Leaf Spray masspektrometri: En snabb omgivande jonisering teknik för att direkt bedöma metaboliter från växt vävnader
Summary
Leaf spray masspektrometri är en direkt kemisk analys teknik som minimerar provpreparering och eliminerar kromatografi, vilket möjliggör snabb påvisande av små molekyler från växt vävnader.
Abstract
Växter producerar tusentals små molekyler som är olika i deras kemiska egenskaper. Masspektrometri (MS) är en kraftfull teknik för att analysera växt metaboliter eftersom det ger molekylvikter med hög känslighet och specificitet. Leaf spray MS är en omgivande jonisering teknik där växtvävnad används för direkt kemisk analys via elektrospray, eliminera kromatografi från processen. Detta förhållningssätt till provtagning metaboliter möjliggör ett brett spektrum av kemiska klasser att upptäckas samtidigt från intakt växt vävnader, minimera mängden provberedning krävs. När den används med en hög upplösning, exakt samlas MS, underlättar leaf spray MS snabb upptäckt av metaboliter av intresse. Det är också möjligt att samla in tandem mass fragmentering data med denna teknik för att underlätta en sammansatt identifiering. Kombinationen av noggranna massa mätningar och fragmentering är fördelaktigt i bekräftar sammansatta identiteter. Leaf spray MS teknik kräver endast mindre ändringar av en nanospray jonisering källa och är ett användbart verktyg för att ytterligare utöka funktionerna i en masspektrometer. Här, analyseras färska bladvävnad från Sceletium tortuosum (isörtsväxter), en traditionell medicinalväxt från Sydafrika, talrika mesembrine alkaloider upptäcks med leaf spray MS.
Introduction
Växter innehåller ett brett utbud av små molekyler med olika kemiska egenskaper. MS är en kraftfull teknik för att analysera växt föreningar eftersom det kan ge elementär kompositioner med hög känslighet och specificitet för detektering och identifiering av metaboliter1. Vanligast, utförs MS på lösningsmedel-extraherade prover, som skiljs åt genom kromatografi innan MS analys1. Dock användningen av vätskekromatografi (LC) kräver långa analys gånger och förknippas ofta med ett omfattande prov förberedelse1. Däremot direkt kemisk analys av intakta vävnader som kringgår kromatografi är en mycket snabb teknik, som kräver minimal prov förberedelse2. Således, i fall där kromatografiska steg kan vara efterskänks, en direkt kemisk analys kan vara mycket fördelaktigt.
Typiska LC-MS för naturliga produkter och metabolomik forskning bygger på långa bulk extraktioner av torkad eller fryst växtmaterial som innehåller flera vävnader och cell typer3. Alternativt kan direkt kemisk analys, till exempel MS påvisning av metaboliter från växtvävnad, isolera celltyper och undvika förberedelse artefakter4. Leaf spray MS, även kallad vävnad-spray5,6, är en direkt omgivande jonisering MS-teknik, vilket kräver i princip inget prov förberedelse5,7. Leaf spray MS är nära besläktad med papper spray MS, en omgivande jonisering teknik med egenskaper av elektrospray jonisering som möjliggör upptäckt av analyter som deponeras på papper7. Trots namnet, leaf spray MS är tillämplig på olika typer av växt vävnader, inte bara lämnar och har visat på frukt, frön, rötter, blommig vävnader och knölar, bland annat6,8,9, 10,11,12. Tekniken underlättar joniseringen av endogena fytokemikalier direkt från växtmaterial i massa spektrometern för upptäckt8. Leaf spray MS kan också ge information om den rumsliga fördelningen av kemikalier i olika vävnadstyper i växter13. När leaf spray MS jämförs med vätskeextraktion och LC-MS, tyder resultaten leaf spray MS möjliggör snabb påvisande av surface metaboliter från unika celltyper som trichomes13. Figur 1 illustrerar leaf spray MS experimental set-up. Direkta elektrospray jonisering uppstår efter endast smärre källa ändringar. En hög spänning appliceras på anläggningen vävnad via en metall klämma, producerar en spray med mycket laddad droppar bildar en Taylor-kon som bär jonerna till den MS. Electrospray ion inlopp jonisering uppstår från den naturliga vätskan av växten eller den lösningsmedel appl IED anläggning yta. En spetsig spets på vävnad underlättar elektrospray och kan vara naturligt förekommande eller skapas genom att skära.
Leaf spray MS är en snabb metod för kvalitativ och semikvantitativ analys av intakt växt vävnader som har hittat verktyget för en mängd olika applikationer. Tekniken har till exempel använts för att upptäcka endogena föreningar att skilja besläktade arter, och även att utvärdera förändringar i samma art odlas under olika förhållanden. Tidigare studier har visat detta synsätt genom att mäta metaboliter i beautyberry (Callicarpa L.) 12 och amerikansk ginseng (Panax quinquefolium L.) 6. i det senare exemplet ginsenosider, aminosyror och oligosackarider kunde detekteras efter vätning raw ginseng vävnad. Vilda och odlade amerikansk ginseng var åtskilt från knölen skivor6. Ginseng tuber integriteten bevarades efterföljande blad spray MS, som möjliggjorde en efterföljande morfologiska och mikroskopisk inspektion6. Dessutom kan exogena föreningar på växtprover också upptäckas. Ett antal bekämpningsmedel (acetamiprid, difenylamin, imazalil, linuron och tiabendazol) har upptäckts på skal eller massa av frukt och grönsaker9. Medan dessa studier och många andra har visat nyttan av leaf spray MS för olika specifika ändamål, har ett detaljerat protokoll inte tidigare rapporterats.
Här kommer protokollet beskrivningen inte fokuserar på optimering av metoden för en specifik vävnad eller sammansatta. Snarare, detektion av mesembrine alkaloider från Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (isörtsväxter) används som ett exempel för att diskutera de nödvändiga optimering åtgärder som bör vidtas när du konfigurerar ett blad spray MS experiment för en art, vävnad, eller andra för första gången. S. tortuosum är en saftiga ingår i släktet regionen halvtorra Karroo i Sydafrika. En traditionell medicin av San och Khoi Khoi bemannar, det användes för aptit och törst dämpning samt när det gäller dess psykotropa och analgetiska effekter14,15. För närvarande används standardiserade extrakt för behandling av neuropsykiatriska och neuropsykologiska störningar16,17. De primära föreningarna av intresse inkluderar den alkaloiden mesembrine och dess derivat, varav många finns också i relaterade Sceletium arter15. Både vilda och odlade populationer av S. tortuosum har varierande koncentrationer av mesembrine alkaloider, alltså presentera en kvalitetskontroll utmaningen18. En metod för snabb påvisande av mesembrine alkaloider, såsom blad spray MS, kan vara användbar i övervakning Sceletium produkter. Eftersom tidigare, det hade ingen detaljerad visuell experimentellt protokoll för leaf spray MS teknik, vi kommer att illustrera metoden i exemplet med S. tortuosumoch följande beskrivs: ändring av en nanospray källa, den urval och förberedelse av växt vävnader, förvärvet av data, tolkningen av resultaten och optimering av parametrarna MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lyckad användning av detta protokoll är beroende av optimering av olika steg för växtarter, vävnadstyp och mål andra sevärdheter. De parametrar som beskrivs i protokollet ger en bra utgångspunkt. Följande experimentella beslut måste vara tillverkade och testade: om huruvida att använda (1) klippa eller oklippt vävnad och (2) lösningsmedel eller inget lösningsmedel, (3) vilken vätska du använder och i vilken volym, (4) vad vävnad från ion inlopp bör avståndet vara , och (5) spänning amplituden. Målet…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av NSF växt Genome Research Program bidraget IOS-1238812 och den postdoktorsstipendium i biologi IOS-1400818. Arbetet finansierades också ett Monsanto Graduate Student stipendium till Katherine A. Sammons. Fulbright afrikanska forskare forskare programmet (2017-2018) är tackade för finansieringen tilldelas Nokwanda P. Makunga. Vi uppskattar donation av en nanospray källa från Jessica Prenni och proteomik och metabolomik anläggningen vid Colorado State University.
Materials
| Conn Pin | Digi-Key elctronics | WM2563CT-ND | pin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage |
| small clamp | Digi-Key elctronics | 314-1018-ND | CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A |
| large clamp | Digi-Key elctronics | 290-1951-ND | ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A |
| Heat shrink | Digi-Key elctronics | Q2Z1-KIT-ND | to cover soldering joints |
| NSI source Nanospray Ion Source | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap | Thermo scientific | NA | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument |
| Tune Software | Thermo scientific | Another brand will work if you are not using a Thermo instrument | |
| Xcalibur Software | Thermo scientific | ||
| Plant of interest – S. tortousum |
Riferimenti
- Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography – mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
- Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
- Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
- Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
- Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
- Chan, S. L. -. F., Wong, M. Y. -. M., Tang, H. -. W., Che, C. -. M., Ng, K. -. M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
- Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
- Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
- Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
- Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
- Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
- Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
- Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
- Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
- Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
- Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
- Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
- Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
- Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
- Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
- . GNPS Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018)
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
- Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
- Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
- Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate?. Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
- Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
- Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
- Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).
