JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochimica

Yaprak sprey kütle spektrometresi: Doğrudan metabolitleri bitki doku üzerinden değerlendirmek için bir hızlı ortam iyonlaşma tekniği

Published: June 21, 2018
doi:
10.3791/57949
, , , ,
1Department of Horticultural Science, Microbial and Plant Genomics Institute,University of Minnesota, 2Department of Horticultural Science, Department of Plant and Microbial Biology, Microbial and Plant Genomics Institute,University of Minnesota, 3Department of Botany and Zoology,Stellenbosch University

Summary

Yaprak sprey kütle spektrometresi numune hazırlama en aza indirir ve küçük moleküller bitki doku üzerinden hızlı tespiti için izin kromatografi, ortadan kaldırır bir doğrudan kimyasal analiz tekniğidir.

Abstract

Bitkilerin kimyasal özelliklerini çeşitli küçük moleküller binlerce üretmek. Kütle spektrometresi (MS) yüksek duyarlılık ve özgüllük ile moleküler ağırlık sağladığı için bitki metabolitleri analiz etmek için güçlü bir tekniktir. Yaprak sprey MS bitki doku electrospray, kromatografi işleminden ortadan kaldırılması yoluyla doğrudan kimyasal analiz için kullanıldığı bir ortam iyonlaşma tekniğidir. Bu yaklaşım metabolitleri örnekleme için çok çeşitli kimyasal sınıfları için aynı anda numune hazırlama gerekli miktarını en aza indirerek olduğu gibi bitki dokulardan tespit edilmesini sağlar. Yüksek çözünürlüklü, doğru kitle MS ile kullanıldığında, yaprak sprey MS metabolitleri ilgi hızlı algılama kolaylaştırır. Bileşik bir kimlik kolaylaştırmak için bu tekniği ile tandem kitle parçalanma veri toplamak mümkündür. Doğru kitle ölçümler ve parçalanma ile birlikte bileşik kimlikleri doğrulayan faydalıdır. Yaprak sprey MS teknik bir nanospray iyonizasyon kaynağı sadece küçük değişiklikler gerektirir ve daha fazla bir kütle spektrometre yeteneklerini genişletmek için yararlı bir araçtır. Burada, tortuosum tortuosum (Aizoaceae), Güney Afrika, geleneksel bir tıbbi bitki dokudan taze yaprak analiz edilir; çok sayıda mesembrine alkoloidler yaprak sprey MS ile tespit edilir.

Introduction

Bitkiler küçük moleküller çeşitli kimyasal özelliklere sahip geniş bir yelpazesi içerir. MS elemental besteleri yüksek duyarlılık ve özgüllük ile algılama ve metabolitleri1tanımlaması için-ebilmek sağlamak o çünkü bitki bileşikleri analiz etmek için güçlü bir tekniktir. En sık, MS MS Analizi1önce Kromatografi ayrılır solvent çıkarılan örnekleri gerçekleştirilir. Ancak, sıvı kromatografi (LC) kullanımı uzun analiz kez gerektirir ve genellikle bir kapsamlı örnek hazırlık1ile ilişkilidir. Buna ek olarak, kromatografi kaçınmanızı sağlar doğrudan kimyasal sağlam doku analizi en az örnek hazırlama2gerektiren bir çok hızlı, bir tekniktir. Böylece, nerede kromatografik adımları forgone durumlarda, doğrudan kimyasal analizi son derece avantajlı olabilir.

Tipik LC-MS doğal ürünler ve metabolomics araştırma için birden fazla doku ve hücre türleri3içeren kurutulmuş veya dondurulmuş bitki malzemelerin uzun toplu çekimi üzerinde dayanır. Alternatif olarak, doğrudan kimyasal analizi, metabolitleri bitki dokusundan MS tespiti gibi hücre tipleri yalıtmak ve hazırlık eserler4kaçının. Yaprak sprey MS olarak doku-sprey5,6, da, hiçbir örnek hazırlama75,esas gerektirir bir doğrudan ortam iyonlaşma MS tekniktir. Yaprak spreyi MS yakından kağıt sprey MS, bir ortam iyonlaşma teknik özellikleri kağıt7yatırılır analitler tespiti için sağlar electrospray iyonlaşma ile ilgilidir. Rağmen adını, yaprak sprey MS bitki doku türleri için geçerlidir, sadece yaprakları ve oldu6,8,9, meyve, tohum, kök, çiçek doku ve yumrular, diğerleri arasında olarak gösterdi 10,11,12. Teknik doğrudan bitki malzemelerden endojen fitokimyasallar iyonlaşma algılama8için kütle spektrometre içine kolaylaştırır. Yaprak sprey MS Ayrıca kimyasal bitki13farklı doku türlerine kayma dağıtımı hakkında bilgi sağlar. Yaprak sprey MS solvent ekstraksiyon ve LC-MS ile karşılaştırıldığında sonuç yaprak sprey MS yüzey metabolitleri hızlı tespiti için trichomes13gibi benzersiz hücre türleri sağlar öneririz. Şekil 1 yaprak sprey MS deneysel ayarı gösterir. Doğrudan electrospray iyonlaşma yalnızca küçük kaynak değişiklikleri sonra oluşur. Yüksek gerilim ile metal kelepçe bitki doku uygulanır, bir sprey Bayan Electrospray iyon giriş için iyonları taşıyan bir Taylor koni oluşturan çok damlacıkları üreten iyonlaşma bitkisinin doğal sıvı veya solvent Uygula oluşur IED bitki yüzeyine. Doku üzerinde bir sivri uç electrospray kolaylaştırır ve kesim tarafından meydana gelen veya oluşturulan doğal olarak olabilir.

Yaprak sprey MS yarar-si olmak kurmak geniş bir uygulama yelpazesi için olduğu gibi bitki doku nitel ve yarı nicel analizi için hızlı bir yöntemdir. Örneğin, teknik endojen bileşikleri ilişkili tür ayırt etmek ve hatta farklı koşullar altında yetiştirilen aynı tür değişimler değerlendirmek için algılamak için kullanılan. Önceki çalışmalar beautyberry (Callicarpa L.) metabolitler ölçerek bu yaklaşım göstermiştir 12 ve Amerikan ginseng (Panax quinquefolium L.) 6. ikinci örnekte, ginsenosides, amino asitler ve oligosakkaritler ham ginseng doku ıslatma sonra tespit edilemedi. Vahşi ve ekili Amerikan ginseng yumru dilimleri6‘ dan farklı. Ginseng yumru bütünlüğü için bir sonraki morfolojik ve mikroskobik muayene6izin izleyen yaprak sprey MS, korundu. Ayrıca, bitki örnekleri eksojen bileşikler de tespit edilebilir. Böcek ilaçları (acetamiprid, difenilamin, imazalil, linuron ve thiabendazole) bir dizi kabuğu veya meyve ve sebze9hamuru tespit edildi. Bu çalışmalar ve diğer pek çok yaprak sprey MS yarar çeşitli özel amaçlı göstermiştir iken, detaylı bir protokol daha önce bildirilmemiştir.

Burada, protokol açıklama yöntemi belirli bir doku veya bileşik optimizasyon üzerinde odaklanmak değil. Aksine, mesembrine alkoloidler üzerinden tortuosum tortuosum (L.) N.E.Br. (Aizoaceae) algılama örnek olarak bir yaprak sprey MS deneme için bir tür, doku, ayarlarken alınması gereken gerekli optimizasyonu önlemleri görüşmek üzere kullanılan veya ilk kez compound(s). S. tortuosum Güney Afrika’nın yarı kurak Karroo bölgesine sulu bir endemik var. Geleneksel tıp San ve Khoi Khoi halklar, iştah ve susuzluk bastırılması de onun psikotropik ve analjezik etkileri14,15gelince için kullanıldı. Şu anda standart özü nöropsikiyatrik ve nöropsikolojik bozukluklar16,17tedavisi için kullanılmaktadır. Birincil bileşikler ilgi alkaloid mesembrine ve birçoğu da ilgili tortuosum türler15‘ te bulunur onun türevleri içerir. S. tortuosum vahşi ve ekili nüfus mesembrine alkoloidler, değişken konsantrasyonları böylece bir kalite kontrol meydan okuma18sunulması var. Bir yöntem gibi yaprak sprey MS, mesembrine alkoloidler hızlı tespiti için tortuosum ürünleri izlemek yararlı olabilir. Çünkü daha önce yaprak spreyi MS tekniği için detaylı görsel Deneysel protokol olmuştu, S. tortuosumörneği kullanarak yöntemi gösterilecektir ve aşağıda anlatılan: nanospray kaynak modifikasyonu seçimi ve bitki dokularında hazırlanması, verileri edinimi, sonuçların yorumlanması ve MS parametrelerinin optimizasyonu.

Protocol

1. Nanospray kaynak yaprak için yapılan değişiklikler MS sprey Değiştirilmiş nanospray kaynak yaprak sprey MS için kullanın. Herhangi bir sıvı bileşen yaprak sprey MS için gerekli olduğundan, kaynak kaynak LC sonda kaldırarak değiştirin. Bitki doku kaynak tanıttığım için uygun iğne ile gerilim uygulanacağı yaprak sprey MS tel bir araya getirin. PIN bir sonuna kadar yalıtılmış bir tel lehim; bir kelepçe tel ters sonuna lehim.Not: Kelepçe (timsah klip türü) diş olab…

Representative Results

10 hafta sonrası çimlenme, taze toplanan sera yetiştirilen S. tortuosum yaprakları yaprak sprey MS tarafından analiz edildi. S. tortuosum üzerinden metabolitleri algılamak için deneysel iş akışı MS Şekil 2′ de gösterildiği yaprak sprey kullanarak bırakır. Bir yaprak bir noktası oluşturmak için bir konik ucuyla ince bir şerit halinde kesip, seçilen ve yaprak sprey MS tel kelepçe aparatı ile sabitlenmiş. Bitki doku ~ 3…

Discussion

Bitki türleri, doku türü ve hedef compound(s) ilgi için çeşitli adımlar optimizasyonu başarılı kullanımı, bu iletişim kuralını kullanır. İletişim kuralında tanımlanan parametreler iyi bir başlangıç noktası sağlar. Aşağıdaki deneysel kararlar yapılan test ve olması gereken: olsun veya olmasın kullanımı (1) kesme veya kesilmemiş doku ve (2) çözücü veya hiçbir solvent, kullanmak için (3) ne solvent ve hangi birim, (4) ne iyon giriş dokudan mesafe olmalıdır ve (5) gerilim genlik. En…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser NSF bitki genom araştırma programı hibe IOS-1238812 ve doktora sonrası bursu biyoloji IOS-1400818 tarafından finanse edildi. Çalışma ayrıca bir Monsanto yüksek lisans öğrencisi bursu için Katherine A. Sammons tarafından finanse edildi. Fulbright Afrika araştırmacı âlimler Program (2017-2018) Nokwanda s. Makunga için layık finansmanı için teşekkür etti. Jessica Prenni nanospray kaynaktan bağış ve Colorado State Üniversitesi’nde proteomik ve Metabolomics tesis takdir.

Materials

Conn Pin Digi-Key elctronics  WM2563CT-ND pin will insert into Thermo Scientific  source to provide voltage 
small clamp Digi-Key elctronics  314-1018-ND CLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clamp Digi-Key elctronics  290-1951-ND ALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrink Digi-Key elctronics  Q2Z1-KIT-ND to cover soldering joints 
NSI source Nanospray Ion Source Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole Orbitrap Thermo scientific NA Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune Software Thermo scientific Another brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur Software Thermo scientific
Plant of interest – S. tortousum
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography – mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  2. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
  3. Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
  4. Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  5. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  6. Chan, S. L. -. F., Wong, M. Y. -. M., Tang, H. -. W., Che, C. -. M., Ng, K. -. M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
  7. Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
  8. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  9. Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
  10. Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
  11. Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
  12. Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
  13. Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
  14. Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
  15. Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
  16. Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
  17. Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
  18. Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
  19. Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
  20. Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
  21. . GNPS Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018)
  22. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  23. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  24. Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
  25. Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
  26. Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate?. Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
  27. Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
  28. Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
  29. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).

Tags

Leaf Spray Mass SpectrometryAmbient IonizationPlant MetabolitesSceletium TortuosumMesembrine AlkaloidsPesticidesSample PreparationNano Spray SourceContaminant IonsData File
check_url/it/57949?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Freund, D. M., Sammons, K. A., Makunga, N. P., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues. J. Vis. Exp. (136), e57949, doi:10.3791/57949 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image