ショウジョウバエ幼虫の温度設定を決定する温度勾配試験
Summary
ここでは、連続的な温度勾配を利用したショウジョウバエ幼虫の最寄りの環境温度を決定するプロトコルを提案する.
Abstract
ミバエショウジョウバエを含む多くの動物は、肥えた最寄り熱風景を模索することができます環境温度のわずかな違いが可能です。幼虫の温度の設定を定義すると、定義された線形範囲にわたって、温度勾配を使用してアッセイを開発しました。単一方向のグラデーションを確立するには、2 つのアルミ ブロックは個々 のブロックの温度を制御する独立した水のお風呂に接続されます。2 つのブロックは、グラデーションの上下限値を設定します。温度勾配は、プレート間の距離にまたがる 2 水制御ブロックをアガロース コーティング アルミ プレートを配置することによって確立されます。水ブロックの上に設定されているアルミ板の両端の最小値と最大温度を定義および中間の地域 2 つのブロックを形成する線形温度勾配。グラデーションのアッセイの幼虫に適用できるし、TRP チャネルと温度差別に必要なオプシン遺伝子に影響を与える突然変異などの表現型を示す変異体を識別するために使用することができます。
Introduction
モバイル動物によって温度走性を採用して、最も有利な条件1,2,3環境を選択します。過度に熱いまたは冷たい気候になった場合、この動作は生存に不可欠です。さらに、多くの動物は快適な範囲の温度の非常に小さい相違に敏感であるし、理想的な温度環境を模索します。これは、環境と自分の体の温度を平衡ショウジョウバエなど poikilothermic 生物にとって特に重要なのです。幼虫の温度走性を監視するための試金は識別し、ショウジョウバエ一過性受容体電位 (TRP) チャネル4,5,6など分子センサーの役割を明確に尽力しています。ロドプシン7、8、およびイオン型受容体受容体 (IRs)9、異なった温度較差上の温度感度を持つこれらの動物のため。
双方向の選択のテストは、幼虫6,7熱の好みを勉強する 1 つの方法を提供します。アッセイは、2 つの異なる温度ゾーンを確立することを伴なうし、動物他の上の 1 つの側面を選択することができます。双方向選択テストの結果は、堅牢な 2 つのオプションの間の温度差が大きい場合に特にすることができます。さらに、各分析には集計のみ 2 つのグループが含まれているので、データはシンプルな設定インデックスとして表現できます。使いやすさと双方向選択の試金のシンプルさは、遺伝子スクリーニングに適しています。しかし、主要な制限は、多くの実験動物の野生型や突然変異体の最寄りの温度を確立する必要は。
グラデーションのアッセイでは、単一のアッセイ8最寄りの温度を確立する機会を提供しています。さらに、双方向の選択テストとは異なり温度の連続的な範囲に直面したとき、動物の集団の分布の評価が可能です。1 つのグラデーション アッセイ ペトリ皿と単一動物を使用し、個々 の動物10の詳細な動作評価に適しています。ただし、ペトリ皿はラウンドなので温度ゾーンのサイズによって異なります、中心からの距離に応じて徐々 に小さい。したがって、このセットアップは、動物の集団の温度の選択のモニタリングに最適ではありません。
幼虫のグループの温度の設定を評価するために適しています連続熱勾配装置は、長方形のアリーナを採用し、ここに記載されています。装置は簡単に構築し、組み立てます。また、グラデーションは線形で、42 ° C まで 10 ° C から広い温度範囲で温度走性を評価するために使用することができますは、柔軟です、試金は迅速かつ簡単に実行を再現性のあるデータが得られます。幼虫の支持された温度のレポート作成に加えて、それは単一の実験で線形範囲全体に対する動物の人口の好みを明らかにします。これらの利点のための温度走性に関与する遺伝子を特定するための優れた選択肢です。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの成功を確保するため、幼虫の実験を行うための十分な番号を取得する手順を取ることが重要です。あらかじめ産卵を改善するために 2-3 d 酵母貼り付け含むバイアル中のハエを餌が含まれます。バイアルは水の瓶を含むトレイに置かれ、食品の水分を保持し、通常の光サイクルへの露出を確保しながらの幼虫によって効果的な摂食を促進する透明なプラスチック袋に封入する…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. m. は NIDCD (DC007864、DC016278) (EY008117、EY010852)、ネイから資金援助によってサポートされて、NIAID (1DP1AI124453)。
Materials
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
Riferimenti
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- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
- Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
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- Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: a laboratory handbook. , (2005).
