مقايسة تدرج درجة الحرارة لتحديد تفضيلات الحرارية يرقات المورفولوجية
Summary
نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحديد درجة الحرارة البيئية المفضل لليرقات المورفولوجية استخدام تدرج حراري مستمر.
Abstract
العديد من الحيوانات، بما في ذلك ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، قادرون على تمييز الفروق الدقيقة في درجة الحرارة البيئية، التي تمكنهم من البحث عن المناظر الطبيعية الحراري المفضل. تحديد تفضيلات اليرقات درجات الحرارة أكثر من مجموعة خطية محددة، قمنا بتطوير فحص استخدام تدرج درجات الحرارة. إنشاء تدرج لوني واحد ثنائي الاتجاه، ترتبط اثنين من كتل الألومنيوم لحمامات مياه مستقلة، كل منها ضوابط درجة حرارة كتل الفردية. الكتلتين تعيين الحدود الدنيا والعليا للتدرج. هو إنشاء التدرج درجة الحرارة بوضع صفيحة ألومنيوم [اغروس] المغلفة اثنين من كتل التحكم في المياه حيث أن اللوحة تمتد المسافة بينهما. ينتهي لوحة الألومنيوم التي تم تعيينها على رأس كتل المياه يحدد درجات الحرارة الدنيا والقصوى، ومناطق الفترات الفاصلة بين الكتلتين تشكل درجة الحرارة تدرج خطي. تحليل الانحدار يمكن تطبيقها على اليرقات من مختلف الإعمار، ويمكن استخدامها لتحديد طفرات أن المعرض تعمل، مثل تلك التي مع الطفرات التي تؤثر على الجينات ترميز قنوات الحزب وأوبسينس، ومطلوبة من أجل تمييز درجة الحرارة.
Introduction
وتستخدم الحيوانات المتنقلة لتحديد بيئة مواتية أكثر الشروط1،2،3ثيرموتاكسيس. إذا كان المناخ مفرطة الساخنة أو الباردة، أمر حيوي للبقاء هذا السلوك. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الحيوانات حساسية للاختلافات الصغيرة جداً في درجة الحرارة في مجموعة مريحة والبحث عن المناطق المحيطة بها مع درجة حرارة مثالية. وهذا أهمية خاصة بالنسبة للكائنات بويكيلوثيرميك مثل ذباب الفاكهة، وحجته بدرجة حرارة الجسم مع البيئة. فحوصات لمراقبة اليرقات ثيرموتاكسيس قد ساعدت في تحديد وتوضيح دور كل من أجهزة الاستشعار الجزيئية مثل المورفولوجية مستقبلات عابر المحتملة (الحزب) قنوات4،،من56، رهودوبسينس7،8وإيونوتروبيك مستقبلات مستقبلات (IRs)9، التي تضفي هذه الحيوانات مع الحساسيات درجة الحرارة على نطاقات مختلفة في درجة الحرارة.
اختبار اختيار اتجاهين يوفر نهج واحد لدراسة تفضيلات الحرارية في اليرقات6،7. المقايسة يستتبع إنشاء منطقتين حرارة متميزة ويسمح للحيوانات لتحديد جانب واحد على الآخر. يمكن أن تكون نتائج اختبارات الاختيار ثنائية قوية، لا سيما إذا كانت الاختلافات في درجة الحرارة بين الخيارين كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، أن كل مقايسة تتضمن جدولة المجموعات اثنين فقط، يمكن التعبير عن البيانات كمؤشر لتفضيل بسيطة. السهولة والبساطة في اختيار اتجاهين فحوصات قابلة أيضا لشاشات الجينية. ومع ذلك، قيداً رئيسيا أن هناك حاجة تحديد درجة الحرارة المفضلة للحيوانات البرية من نوع أو متحولة إلى العديد من التجارب.
مقايسة تدرج يتيح الفرصة لإنشاء درجة الحرارة المفضلة في مقايسة واحدة8. وعلاوة على ذلك، خلافا لاختبار الخيار ذات اتجاهين، ويسمح تقييم توزيع مجموعة من الحيوانات، عندما تواجه مع نطاق متواصل من درجات الحرارة. تحليل الانحدار واحد يستخدم طبق بيتري والحيوانات وحيدة ومناسبة تماما لوصف سلوك الحيوانات الفردية10مفصل. ومع ذلك، منذ جولة أطباق بيتري، أحجام المناطق درجة الحرارة تختلف وهي تدريجيا أقل اعتماداً على المسافة من المركز. ولذلك، هذا الإعداد ليست مثالية لرصد التحديدات درجة الحرارة من سكان حيوانات.
جهاز تدرج حراري مستمر التي مناسبة تماما لتقييم تفضيلات درجة الحرارة لمجموعات من اليرقات توظف ساحة مستطيلة الشكل، ويرد هنا. الجهاز بسيط لبناء وتجميع. وباﻹضافة إلى ذلك، الانحدار الخطي، وهو مرن، كما يمكن استخدامه لتقييم ثيرموتاكسيس على درجة حرارة كبيرة تتراوح بين 10 درجات مئوية إلى 42 درجة مئوية. المقايسة سريعة ومباشرة لأداء وتعطي البيانات استنساخه. بالإضافة إلى الإبلاغ عن درجة الحرارة المفضلة لليرقات، فإنه يكشف عن أفضليات سكان الحيوانات على مجموعة خطية كاملة في تجربة واحدة. ونظرا لهذه المزايا، خيار ممتاز لتحديد الجينات المطلوبة ثيرموتاكسيس.
Protocol
Representative Results
Discussion
لضمان النجاح لهذا البروتوكول، من المهم اتخاذ خطوات للحصول على العدد الكافي من اليرقات لإجراء التجارب. وتشمل هذه التغذية قبل الذباب في قارورة تحتوي على لصق الخميرة لمد 2-3 لتحسين وضع البيض. قارورة تحتاج إلى وضعها في علبة تحتوي على قارورة الماء ومحاطة بكيس من بلاستيك واضحة، مما يحافظ على الر?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.M. هي مدعومة بتمويل من نيي (EY008117، EY010852)، نيدكد (DC007864، DC016278) ونييد (1DP1AI124453).
Materials
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
Riferimenti
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
- Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
- Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
- Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: a laboratory handbook. , (2005).
