Градиент температуры пробирного для определения тепловой предпочтения личинок дрозофилы
Summary
Здесь мы представляем протокол для определения предпочтительного окружающей температуры личинок дрозофилы , с помощью непрерывного тепловой градиент.
Abstract
Многие животные, в том числе плодовой мушки Drosophila melanogaster, способны взыскательные мелкие различия в температуре окружающей среды, что позволяет им искать их предпочтительным тепловой ландшафта. Для определения температуры предпочтения личинок за определенный диапазон линейных, мы разработали assay с использованием градиента температуры. Создать один направленного градиент, два алюминиевых блоков цилиндров подключены к независимым водяные бани, каждый из которых контролирует температуру отдельных блоков. Два блока установки нижнего и верхнего пределов градиента. Градиент температуры устанавливается, поместив агарозы покрытием алюминиевой пластине двух блоков под контролем воды так, чтобы пластины охватывает расстояние между ними. Концы алюминиевой пластине, что находится на вершине блоков воды определяет минимальные и максимальные температуры, и промежуточных областей двух блоков образуют линейный градиент температуры. Градиента могут быть применены к личинок разных возрастов и может использоваться для идентификации мутантов, которые демонстрируют фенотипы, например с мутациями затрагивающих гены, кодирующие ГТО каналы и опсины, которые требуются для температуры дискриминации.
Introduction
Чтобы выбрать среду с наиболее благоприятные условия1,2,3мобильных животных работает терморегуляцию. Если Климат слишком горячей или холодной, такое поведение является жизненно важным для выживания. Кроме того многие животные чувствительны к очень небольшие различия в температуре в пределах удобной и искать окрестности с идеальной температуры. Это имеет особое значение для пойкилотермных организмов, таких как плодовых мух, которые сбалансировать температура их тела с окружающей средой. Анализы для мониторинга личиночной терморегуляцию сыграли важную роль в определении и уточнении роли молекулярных сенсоров например дрозофилы переходных потенциальных рецепторов (ГТО) каналы4,5,6, хромопротеинам7,8и ИОНОТРОПНЫХ рецепторов рецепторы (IRs)9, которые наделения этих животных с температурой чувствительности различных температурных диапазонах.
Двусторонний выбор тест предоставляет один из подходов к изучению тепловой предпочтения в личинки6,7. Влечет за собой установления двух различных температурных зон и позволяет животных для выбора одной стороны над другой. Результаты тестов двусторонний выбор может быть надежной, особенно если большой разницы температур между двумя вариантами. Кроме того поскольку калибровочных предполагает табулированию только две группы, данные может быть выражено как простое предпочтение индекс. Легкость и простота двусторонний выбор анализов также поддаются генетических экраны. Однако главным недостатком является, что многие эксперименты, обязаны установить предпочтительный температуры одичал тип или мутанта животных.
Градиент пробирного предлагает возможность установить предпочтительный температуры в одном пробирного8. Кроме того в отличие от двусторонней выбор теста, он разрешает оценки распределения группы животных, когда они сталкиваются с непрерывный диапазон температур. Один из градиента использует чашку Петри и одиночные животные и хорошо подходит для квалификации поведением отдельных животных10. Однако поскольку Петри раунд, размеры температурных зон варьируются и постепенно меньше, в зависимости от расстояния от центра. Таким образом эта установка не является идеальным для контроля температуры выбор популяций животных.
Постоянной тепловой градиент аппарат, который хорошо подходит для оценки температуры предпочтения групп личинки использует прямоугольную Арена и описан здесь. Аппарат прост для построения и сборки. Кроме того градиент линейной и гибкие, как он может быть использован для оценки терморегуляцию в широком диапазоне температур от 10 ° C до 42 ° C. Быстрый и простой для выполнения и дает воспроизводимость данных. В дополнение к отчетности благоприятствования температура личинок, он раскрывает предпочтения населения животных над целиком диапазона линейной в одном эксперименте. Из-за этих преимуществ это отличный выбор для идентификации генов, необходимых для терморегуляцию.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для обеспечения успеха этого протокола, важно предпринять шаги для получения достаточного количества личинок для выполнения экспериментов. Они включают в себя предварительно кормления мух в дрожжей содержащие паста ампул для 2-3 d улучшить откладки. Флаконы должны быть помещены в лото?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
К.м. поддерживается финансирование от NEI (EY008117, EY010852), NIDCD (DC007864, DC016278) и NIAID (1DP1AI124453).
Materials
| Gradient assay apparatus | |||
| PolyScience 9106, Refrigerated/Heated 6L Circulating Bath | Thomas Scientific | 9106 | This model is discontinued. Updated replacement models include: 1186R00 and 1197U04 for 120 V, 60 Hz, or 1184L08 and 1197U04 for 240 V, 50 Hz. |
| Aluminum assay plate (for single directional gradient) | Outer size: 14 x 10.1 x 0.9 cm, inner size: 12.9 x 8.7 x 0.8 cm, black anodized. | ||
| Aluminum plate (for bidirectional gradient) | 25 x 22 x 0.2 cm, black anodized. | ||
| Aluminum block | Outer size: 25.5 x 5 x 1.4 cm, parameters of inner channels are shown in Figure 1D. | ||
| Connector for aluminum blocks and tubing | McMaster-Carr | 91355K82 | |
| Tygon Sanitary Silicone Tubing | Tygon | 57296 | 1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" wall |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Items and reagents for assay | |||
| Pestle | USA Scientific | 17361 | Pestle for 1.5 mL microcentrifuge tubes |
| Thermometer | Fluke | 51II | |
| Thermocouple | Fluke | K type | |
| Universal microplate lid | Corning | 6980A77 | |
| 35 mm dish | Corning | 9380D40 | |
| Labeling tape (for bidirectional gradient) | Fisher Scientific | 15-951 | Fisherbrand labeling tape 2 in x 14 yds |
| Agarose | Invitrogen | 16500500 | Prepare 1% solution |
| Sucrose | Sigma | S0389-5KG | Prepare 18% solution right before starting assay |
| Paint brush | Fisher Scientific | 11860 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Denville | C1062-P | |
| Scoopula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| 500 mL round wide-mouth bottle | Pyrex | 1395-500 | |
| Cell strainer (300 mm pore) | PluriSelect | 43-50300 | Optional item for larvae washing |
| Cardboard box (vial tray) | Genesee Scientific | FS32-124 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila food | |||
| Distilled water | 22,400 mL | ||
| Cornmeal, yellow (extra fine mesh,flocked) 20 kg | LabScientific Inc. | NC0535320 | 1,609 g |
| Brewers yeast 100 lbs | MP Biomedicals | ICN90331280 | 379 g |
| NutriSoy® Soy Flour (10 kg/unit) | Genesee Scientific | 62-115 | 221 g |
| Drosophila Agar, Type II (5 kg) | Genesee Scientific | 66-103 | 190 g |
| Karo light corn syrup | Karo | 1,700 mL | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate (suspend in 200 proof ethanol) | Sigma Aldrich | H5501-5KG | 72 g/240 mL |
| Propionic acid puriss. p.a.,>99.5% (GC) | Sigma Aldrich | 81910-1 L | 108 mL |
| Phosphoric acid ACS reagent, ≥85 wt. % in H2O | Sigma Aldrich | 438081-500 mL | 8.5 mL |
Riferimenti
- Fowler, M. A., Montell, C. Drosophila TRP channels and animal behavior. Life Sci. 92, 394-403 (2013).
- Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals. Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).
- Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. Peripheral thermosensation in mammals. Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).
- Rosenzweig, M., et al. The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis. Genes Dev. 19, 419-424 (2005).
- Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade. Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).
- Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons. J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).
- Shen, W. L., et al. Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila. Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).
- Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins. Cell Rep. 17, 336-344 (2016).
- Ni, L., et al. The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Luo, L., et al. Navigational decision making in Drosophila thermotaxis. J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).
- Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. . Drosophila: a laboratory handbook. , (2005).
