Il dosaggio di sequestro di lattato deidrogenasi — Un metodo semplice e affidabile per determinare l'attività autofagica sequestro Bulk in cellule di mammifero
Summary
Qui è descritto un protocollo semplice ed e validato per la misurazione di massa autofagica sequestro attività in cellule di mammifero. Il metodo si basa su quantificare la percentuale di lattato deidrogenasi (LDH) in frazioni cellulari sedimentabili rispetto ai livelli LDH cellulari totali.
Abstract
L’autofagia alla rinfusa è caratterizzato tramite il sequestro di grandi porzioni di citoplasma in doppio/multi-membrane strutture definite autofagosomi. Qui è descritto un semplice protocollo per monitorare questo processo. Inoltre, sono disponibili i risultati tipici e validazione sperimentale del metodo in condizioni che inducono autofagia in vari tipi di cellule di mammiferi coltivate. Durante l’autofagia alla rinfusa, autofagosomi sequestrano il citosol e quindi anche proteine citosoliche solubili, a fianco di altri carichi autofagici. LDH è una stabile e altamente solubile, abbondante enzima citosolico che è non-selettivamente sequestrata in autofagosomi. La quantità di sequestro di LDH pertanto riflette la quantità di sequestro autofagica alla rinfusa. Per efficientemente ed esattamente determinare sequestro di LDH in cellule, ci avvaliamo di un protocollo basato su electrodisruption frazionamento che separa efficacemente sedimentabili da citosolico LDH, seguita dalla misurazione dell’attività enzimatica in sedimentabili frazioni contro campioni di cellule intere. Autofagica sequestro è determinato sottraendo la proporzione di sedimentabili LDH in cellule non trattate da quello nelle cellule trattate. Il vantaggio del dosaggio di sequestro di LDH è che dà una misura quantitativa del sequestro autophagic del carico endogeno, al contrario di altri metodi che sia coinvolgere l’espressione ectopica di sequestro sonde o semi-quantitativa della proteasi analisi di protezione di autofagia marcatori o recettori.
Introduction
Autofagia (greco per “auto-eating”) è un processo evolutivo conservato per vacuolar/lysosomal degradazione di materiale intracellulare. Al momento della scoperta dei geni autophagy-relative (“ATG”), che sono importanti per autofagia in lievito ed in esseri umani, e la realizzazione che autophagy svolge un ruolo significativo nella salute e nella malattia (riconosciuto dal premio Nobel 2016 in medicina o fisiologia di Yoshinori Ohsumi), l’autofagia è rapidamente diventato uno dei processi più intensamente studiati in biologia cellulare1,2.
Macroautophagy (in appresso denominato “autofagia”) è caratterizzata dall’espansione e pieghevole di cisterne intracellulare membrana (“phagophores”) in strutture sigillate, doppio – o multi – membrane (“autofagosomi”) che sequestrano efficacemente il materiale avvolto dal resto del citoplasma. Al momento della fusione di autofagosomi con i lisosomi, membrana dell’autofagosoma interiore e il carico sequestrato è degradato e riciclato. Autofagosomi possono sequestrare materiale citoplasmico sia casuale (non-selettivi dell’autofagia) e le buone maniere selettiva (selective autofagia). Bulk autofagia molto probabilmente rappresenta un mix di autofagia selettivo e non selettivi.
Negli anni ‘ 60 e 70 (“la morfologica era” della ricerca di autofagia), sequestro autofagica principalmente è stato valutato attraverso analisi ultrastrutturali. Negli anni ottanta e inizio anni ‘ 90 (“l’era di biochimica”) Per Seglen e colleghi di lavoro — che ha studiato l’autofagia in epatociti primari del ratto — ha sviluppato i primi metodi per misurare quantitativamente autofagica sequestro attività3. Utilizzando queste analisi, Seglen definito e caratterizzato diverse fasi del pathway autofagico-lisosomiale4,5, scoperto e coniato il amphisome6 (il prodotto della fusione di endosome-autofagosoma) e fu il primo a descrivere il ruolo della fosforilazione della proteina nell’autofagia regolamento7. Tuttavia, dopo la scoperta dell’ATG nel 1990 (“l’era molecolare”) e la prima caratterizzazione di una proteina di ATG8 dei mammiferi, proteina microtubule-collegata 1A/1B-luce catena 3 (LC3) nel 20008, l’uso di proteine ATG come marcatori per la processo autofagico rapidamente guadagnato popolarità, e i più vecchi e più laboriosi metodi biochimici sono stati lasciati indietro. Infatti, sopra gli ultimi 18 anni, western blot e analisi di microscopia di fluorescenza di LC3 sono diventati di gran lunga più popolari (e in molti casi l’unico) mezzi di studiare l’autofagia in cellule di mammifero. Il vantaggio è la relativa facilità con cui questi metodi possono essere effettuati. Lo svantaggio è che uno sta studiando un componente carrello (LC3) piuttosto che di effettivo carico autofagico. Questo è uno svantaggio piuttosto grave, perché il rapporto tra gli Stati e/o flusso di LC3 attraverso la via contro il sequestro e il flusso di merci è molto chiaro. Infatti, abbiamo dimostrato che il flusso di merci alla rinfusa può essere mantenuta ad alti livelli in condizioni dove non c’è nessun flusso di LC3, nonostante la presenza di LC3 coniugati in cellule9. Inoltre, abbiamo dimostrato che autophagy di massa non è influenzato da efficiente LC3 svuotamento e quindi probabilmente è LC3-indipendente9. Ciò che trova è stata confermata più tardi da LC3 knock-out studi10,11, che inoltre indicano che mitophagy Parkin-dipendente (l’autofagia selettiva dei mitocondri) è indipendente di LC310,11 .
In sintesi, c’è una chiara esigenza di analisi del carico-based monitorare attività autofagica. In modo ottimale tali dosaggi dovrebbero essere ampiamente applicabili, ben definito e facile da eseguire. Negli ultimi anni abbiamo preso un particolare interesse nell’analisi di sequestro della LDH, che è stato sviluppato da Per Seglen nei12anni ‘ 80 e si basa sulla misurazione del transfer di LDH citosolico a sedimentabili, cella contenenti vacuolo autophagic frazioni. LDH è una proteina citosolica stabile, solubile che co-è prontamente sequestrata quando phagophores enwrap citoplasmico del carico. Sequestro di LDH è pertanto una misura generale di sequestro autofagico. LDH è esclusivamente degradata dalla via autofagica lysosomal12. Così, in presenza di inibitori di degradazione lisosomiale, ad es., methyladenine A1 (Baf)13, direttamente gli effetti del trattamento sperimentale riflettono le alterazioni nell’attività di sequestro autofagici. In assenza di inibitori di degradazione, l’effetto netto delle alterazioni nel sequestro di LDH e degradazione può essere misurata.
Il dosaggio di sequestro di LDH è largamente applicabile, poiché LDH è altamente e ubiquitariamente espressa in tutti i tipi di cellule, e livelli di LDH possono essere quantificati con precisione da un dosaggio enzimatico14,15. Tuttavia, l’originale protocollo12 — stabilito in epatociti primari del ratto — piuttosto che richiede tempo e necessitava di una quantità elevata di inizio materiale nonché un condensatore scarico elettrico su misura. In maniera graduale, abbiamo trasformato gradualmente il dosaggio in un metodo facile e versatile. In primo luogo, il protocollo originale è stato adattato per l’uso in cellule di mammifero linee16. In secondo luogo, il metodo era sostanzialmente ridimensionato3,9. Terzo, sono stati eliminati diversi passaggi nel protocollo, tra cui un cuscino di densità laborioso passo17. Questo permesso simultaneamente un downscaling ulteriormente del metodo, il punto di partenza originale di usando un piatto di 10 cm per esempio16 all’utilizzo di un singolo pozzo da una piastra 12-pozzetti per campione (vale a dire, circa 15 volte meno a partire materiale)17. In quarto luogo, abbiamo identificato un’apparecchiatura di elettroporazione commerciale che potrebbe sostituire il condensatore scarica elettrica su misura17.
Qui è presentato il nostro protocollo più aggiornata del dosaggio di sequestro di LDH, che comprende alcune ulteriori semplificazioni del metodo rispetto al precedentemente pubblicato il17 . Inoltre, viene presentata una serie di tipici risultati ottenuti in un certo numero di diversi tipi di cellule, e soprattutto, più righe di convalide sperimentali del metodo utilizzando farmacologica nonché genetica atterramento e knockout approcci sono forniti. Per uno schema globale di flusso del protocollo intero, Vedi Figura 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
In sintesi, il protocollo descritto qui rappresenta un metodo affidabile e ampiamente applicabile per monitorare l’attività di sequestro autofagica alla rinfusa in cellule di mammifero. Rispetto per l’originale metodo12,16, abbiamo rimosso una serie di passaggi inutili, semplificato molti dei passaggi rimanenti e presentare un downscaling sostanziale. Di conseguenza, il protocollo è notevolmente migliorato in relazione alla efficienza di costi e tempo, e la ste…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Consiglio norvegese della ricerca, dell’Università di Oslo, il Anders Jahre Foundation, la Fondazione di Nansen e l’eredità nella memoria di Henrik Homan. Ringraziamo il dottor Noboru Mizushima per il ATG5 + / + MEFs e ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu per il ATG7 + / + MEFs e ATG7-/-MEFs e Dr. Shizuo Akira per il ATG9A + + MEFs e ATG9A-/-MEFs. Ringraziamo Frank Sætre per assistenza tecnica e Dr. Per O. Seglen per discussioni costruttive metodologiche.
Materials
| 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 211-2130 and 211-2120 | |
| 12-well plates | Falcon | 353043 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | A7089 | Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Dissolve in DMSO |
| BJ cells | ATCC | CRL-2522 | use at passage <30 |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 422361V | |
| Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Cover glass for the Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µl, 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Earle's balanced salt solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | conatains 0.1% glucose |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Electroporation cuvette (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Exponential decay wave electroporator | BTX Harvard Apparatus | EMC 630 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | 10% final concentration in RPMI 1640 medium |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months |
| Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher | 13778150 | |
| LNCaP cells | ATCC | CRL-1740 | use at passage <30 |
| 3-Methyl Adenine (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Heat stock to 65 °C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration |
| Refridgerated Microcentrifuge | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 hydrochloride (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO. |
| MaxMat Multianalyzer instrument | Erba Diagnostics | PL-II | |
| MCF7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher | 31985062 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Pipette tips 3 (0.5-20 µl) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (1-200 µl) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (100-1000µl) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipettes | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year. |
| Pyruvate | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| RPE-1 cells (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO. |
| Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Sucrose | VWR | 443816T | 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO. |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1% final |
| Trypan Blue stain 0.4% | Molecular Probes | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0.01% final |
Riferimenti
- Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi’s Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
- Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
- Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
- Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
- Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
- Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
- Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, 633-636 (1992).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
- Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
- Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
- Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
- Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
- Bergmeyer, H. U., Bernt, E., Bergmeyer, H. U. . Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). 2, 574-579 (1974).
- Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
- Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
- Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
- Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
- Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
- Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
- Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
- Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
- Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
- Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
- Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
- Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
- An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
- Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
- Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
- Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
- Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
- Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
- Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836 (2018).
- Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
- Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
- Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
- Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
- Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).
