Summary

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

Published: July 27, 2018
doi:

Summary

여기 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동을 측정 하기 위한 간단 하 고 잘 검증 된 프로토콜을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 전체 셀룰러 LDH 수준에 비해 sedimentable 셀 분수에 젖 산 효소 (LDH)의 비율을 측정에 기반.

Abstract

대량 autophagy 더블/멀티 membrane 구조에 autophagosomes 되 나 큰 부분의 세포질의 격리에 의해 특징입니다. 여기이 프로세스를 모니터링 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 또한, 일반적인 결과 및 경작된 한 포유류 세포의 다양 한 종류에서 autophagy 유도 조건 방법의 실험적인 검증 제공 됩니다. 대량 autophagy, 동안 autophagosomes cytosol, 그리고 그로 인하여 또한 다른 autophagic 화물 함께 녹는 cytosolic 단백질 격리. LDH는 안정적이 고 높은 비 선택적으로 autophagosomes에 분리 된 풍부 하 고, 녹는 cytosolic 효소 이다. LDH 격리의 양에 따라서 대량 autophagic 격리의 양을 반영합니다. 우리 cytosolic LDH, sedimentable의 효소 활동의 측정에 의해 뒤에서 sedimentable를 효과적으로 분리 하는 분류 electrodisruption-기반 프로토콜을 사용 하는 효율적이 고 정확 하 게 확인 하려면 LDH 격리 셀에, 전체 셀 샘플 대의 분수 Autophagic 격리 sedimentable 그에서 치료 세포 치료 셀에 LDH의 비율을 빼서 결정 됩니다. LDH 격리 분석 결과의 장점은 그것은 다른 방법에 반대 생 화물의 autophagic 격리의 양적 측정 하거나 격리 프로브 또는 반 양적 protease의 소성 식 포함 제공 autophagy 마커 또는 수용 체의 보호 분석입니다.

Introduction

Autophagy (“먹는 자”에 대 한 그리스어) 세포내 물질의 vacuolar lysosomal 저하에 대 한 진화 보존된 과정 이다. 효 모와 인간 autophagy 중요 autophagy 관련 (“ATG”) 유전자의 발견 즉시 실현 그 autophagy 인류 건강 및 질병 (의학 또는 생리학에 있는 노벨상 2016에 의해 인정에 중요 한 역할을 담당 요시노 리 Ohsumi) autophagy 빠르게 되고있다 세포 생물학1,2에서 가장 심각 하 게 공부 과정 중 하나.

Macroautophagy (“autophagy” 라 함)은와 효과적으로 격리 하는, 이중 또는 다중 membrane 구조 (“autophagosomes”)에 세포내 막 cisternae (“phagophores”)의 접는 확장 특징은 휩 싸이 세포질의 나머지에서 자료. Autophagosomes와 리소좀의 융합에 내부 autophagosomal 막과 분리 된 화물은 저하 고 재활용. Autophagosomes 무작위 (비 선택적 autophagy)와 선택적 (선별 autophagy) 매너 세포질 물질을 격리 수 있습니다. 대량 autophagy 대부분 비 선택적이 고 선택적 autophagy의 혼합을 나타냅니다.

1960 년대와 70 년대 (“형태”의 시대 autophagy 연구)에서 autophagic 격리 주로 ultrastructural 분석을 통해 평가 했다. 1980 년대에서 1990 년대 (“생 화 확 적인 시대”) 당 Seglen와 동료의 시작-누가 주 쥐 hepatocytes에서 autophagy 공부-양적 autophagic 격리 활동3를 측정 하는 첫 번째 방법을 개발. 이 분석 실험을 사용 하 여, Seglen 정의 autophagic lysosomal 통로가4,5의 다른 단계를 특징, 발견 만들어낸 amphisome6 (endosome autophagosome 퓨전의 제품), 그리고 처음 autophagy 조절7인 산화 단백질의 역할을 설명 합니다. 그러나, 1990 년대에서 ATGs (“분자 시대”)의 발견과 포유류 ATG8 단백질의 첫 번째 특성, 후 microtubule 관련 단백질 1A/1B-라이트 체인 3 (LC3) 20008, ATG 단백질에 대 한 표식으로의 사용에에서는 autophagic 과정 신속 하 게 얻은 인기, 그리고 더 오래 되 고 더 힘 드는 생 화 확 적인 방법 뒤에 남았다. 사실, 지난 18 년 동안, 서쪽 오 점 및 LC3의 형광 현미경 분석 되었다 지금까지 가장 인기 있는 (그리고 많은 경우에) 공부 하는 포유류 세포에서 autophagy의 의미. 장점은 상대적으로 완화는 이러한 방법을 밖으로 실행 될 수 있다입니다. 단점은 저거 카트 구성 요소 (LC3)을 공부 하 고 실제 autophagic 화물 보다는. 이 상태 또는 격리 대 통로 통해 LC3의 유량과 화물의 유량의 관계를 매우 명확 하지 때문에 오히려 심각한 단점입니다. 사실, 우리는 대량 화물 유동 조건에서 높은 수준에서 유지 될 수 있다 나타났습니다 셀9에 활용 된 LC3의 존재에도 불구 하 고 아무 LC3 플럭스입니다. 또한, 우리는 대량 autophagy 효율적인 LC3 고갈에 의해 영향을 받지 않습니다 이며 따라서 가능성이 LC3 독립적인9시연. 이 찾는 나중 LC3 노크 아웃 연구10,11, 또한 나타낼 Parkin 종속 mitophagy (미토 콘 드리 아의 선택적 autophagy) LC310,11의 독립에 의해 확인 됐다 .

요약 하자면, 분명 있다 autophagic 활동을 모니터링 하 화물 기반 분석에 대 한 필요. 최적으로 적용, 정의 그리고 수행 하기 쉬운 이러한 분석 광범위 하 게 되어야 합니다. 지난 몇 년 동안 우리는 198012, 당 Seglen에 의해 개발 되었다 sedimentable, autophagic 공포 포함 된 셀을 cytosolic LDH의 전송 측정 기반 LDH 격리 분석 결과에 특별 한 관심을가지고 분수입니다. LDH는 안정, 수용 성 cytosolic 단백질 phagophores enwrap 세포질 화물 때에 압수 쉽게 공동. LDH의 격리 따라서 autophagic 격리의 일반적인 척도 이다. LDH는 autophagic lysosomal 통로가12에 의해 독점적으로 저하 됩니다. 따라서, lysosomal 저하 억제제, 예를 들어, bafilomycin A1 존재 (Baf)13, 실험적인 치료 효과 직접 autophagic 격리 활동에 변경 반영. 저하 억제제의 부재, LDH 격리와 저하에 변경의 그물 효과 측정할 수 있습니다.

LDH는 매우 고 편 모든 세포 유형에 표현 때문에 효소 분석 결과14,15LDH 수준을 정확 하 게 정해질 수 LDH 격리 분석 결과 광범위 하 게 적용 됩니다. 그러나, 원래12 프로토콜-기본 쥐 hepatocytes에 설립-오히려 소모 되었고 시작 물자로 만든 전기 방전 커패시터의 높은 금액을 요구. 단계별 방식으로, 우리는 점차적으로 변형 분석 결과 쉽고 다양 한 방법으로. 첫째, 원래 프로토콜 포유류 세포 라인16에 사용 하기 위해 적응 시켰다. 둘째, 방법은 실질적으로 downscaled3,9이었다. 셋째, 프로토콜의 여러 단계에서 탈락 했다,17단계 힘 드는 밀도 쿠션을 포함 하 여. 이 동시에 샘플 (, 적은 약 15 시작 당 12-잘 접시에서 한 우물을 사용 하 여 샘플16 당 10 cm 접시를 사용 하 여 원래 시작 지점에서 메서드의 더욱 상세화를 사용 소재)17. 넷째, 우리는 주문 품 전기 방전 커패시터17를 대체할 수 있는 상업 electroporation 기구 발견.

여기 우리의 최신 프로토콜의 LDH 격리 분석 결과, 이전에 게시17 비교 방법의 몇 가지 더 단순화를 포함 하는 제공 됩니다. 또한, 다른 세포 유형의 수에서 얻은 전형적인 결과 집합이 표시 되 고 중요 한 것은, 유전자 뿐 아니라 약리 최저 및 녹아웃 접근을 사용 하 여 메서드의 실험적인 검증의 여러 줄 제공 됩니다. 전체 프로토콜의 전체 흐름 체계를 위해 그림 1을 참조 하십시오.

Protocol

1. 셀 시드 및 치료 셀에 대 한 선호 문화 매체를 사용 하 여 37 ℃에서 5% CO2 습도 인큐베이터에서 75 cm2 조직 배양 플라스 크에 문화 부착 셀에 입력 합니다. 근처 합칠 셀 계층에 도달할 때까지 성장 하는 세포 수 있습니다.참고: 사용 하 여 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) LNCaP, HEK293, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs), 비제이에 대 한 보충 RPMI 1640 매체 MCF-7 및 RPE-1…

Representative Results

프로토콜을 사용 하 여 여기에 설명 된, LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, 헬러, VCaP, H3122, Hec1A를 포함 하 여 다른 포유류 세포 선의 수에 대량 autophagic 격리 활동 MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ, 및 LNCaP 세포 측정 했다. 격리 (에 완전 한, 영양분이 풍부한 매체), 기저 조건 평가 또는 셀에 심하게 굶 어 혈 청 및 아미노산 (한 보 나 fide autophagy…

Discussion

요약, 여기에 설명 된 프로토콜 포유류 세포에서 대량 autophagic 격리 활동을 모니터링 하는 안정적이 고 광범위 하 게 적용 메서드를 나타냅니다. 원래 방법12,16에 비해, 우리 몇 가지 불필요 한 단계를 제거, 몇몇 나머지 단계를 단순화 하 고 상당한 상세화 도입. 결과적으로, 프로토콜은 크게 관련 비용 및 시간-효율성, 향상 하 고 같은 양의 샘플 이제 원…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품 연구 위원회 노르웨이, 오슬로의 대학, 앤 더 스 년 재단, 난센 재단, 그리고 헨릭 Homan의 메모리에 유산에 의해 재정적으로 지원 되었다. 우리 박사 벅 미즈시마는 ATG5에 대 한 감사 + + MEFs와 ATG5-/-MEFs, 박사 마사 아키 고마쓰는 ATG7에 대 한 + + MEFs 및 ATG7/MEFs, 및 박사 시즈 아키라는 ATG9A에 대 한 + + MEFs 및 ATG9A/MEFs. 우리는 건설적인 방법 론 적 토론에 대 한 기술 지원과 O. Seglen 당 박사에 대 한 프랭크 Sætre을 감사합니다.

Materials

1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes  Eppendorf 211-2130 and 211-2120
12-well plates  Falcon 353043
Accumax  cell detachment solution Innovative Cell Technologies A7089 Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months
Bafilomycin A1 Enzo BML-CM110-0100 Dissolve in DMSO
BJ cells ATCC CRL-2522 use at passage <30
Bovine serum albumin (BSA) VWR 422361V
Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658585
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientfic C10228
Countess II Automated Cell Counter ThermoFisher Scientfic AMQAX1000
Cover glass for the Burker counting chamber Fisher Scientific 139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µl, 13.3 x 8.7 cm (W x L)  Bio-Rad 3450034
DTT Sigma-Aldrich D0632
Earle's balanced salt solution (EBSS) Gibco 24010-043 conatains 0.1% glucose
EDTA Sigma-Aldrich E7889
Electroporation cuvette (4 mm) Bio-Rad 1652088
Exponential decay wave electroporator BTX Harvard Apparatus  EMC 630
Fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524 10% final concentration in RPMI 1640 medium
HEK293 cells ATCC CRL-1573
Imidazole Sigma-Aldrich 56750 Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months
Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator NuAire NU-5510E
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent ThermoFisher 13778150
LNCaP cells ATCC CRL-1740 use at passage <30
3-Methyl Adenine (3MA) Sigma-Aldrich M9281 Stock 100 mM in RPMI in -20 °C.  Heat stock to 65 °C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration
Refridgerated Microcentrifuge Beckman Coulter Life Sciences 368831
Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function Eppendorf  Eppendorf 5417R 
MRT67307 hydrochloride (ULKi) Sigma-Aldrich SML0702 Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO.
MaxMat Multianalyzer instrument Erba Diagnostics PL-II
MCF7 cells ATCC HTB-22
NADH Merck-Millipore 1.24644.001
Nycodenz Axis-Shield 1002424
Opti-MEM Reduced Serum Medium ThermoFisher 31985062
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012-019
Pipette tips 3 (0.5-20 µl) VWR 732-2223 Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (1-200 µl) VWR 732-2207  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipette tips (100-1000µl) VWR 732-2355  Thermo Fischer ART Barrier tips
Pipettes ThermoFisher 4701070 Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-10X5MG Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year.
Pyruvate Merck-Millipore 1066190050
RPE-1 cells (hTERT RPE-1) ATCC CRL-4000
RPMI 1640 Gibco 21875-037
SAR-405 ApexBio  A8883 Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO.
Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) ThermoFisher/Ambion 4390843
Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) ThermoFisher/Ambion s35504
Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) ThermoFisher/Ambion s18995
Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) ThermoFisher/Ambion s15964
Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) ThermoFisher/Ambion s18705
Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) ThermoFisher/Ambion s22362
Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) ThermoFisher/Ambion s24333
Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) ThermoFisher/Ambion s22387
Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O)  Merck-Millipore 1.06580.1000
Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O )  Prolabo 28014.291
Sucrose VWR 443816T 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months
Thapsigargin Sigma-Aldrich T9033 Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO.
Triton X-405  Sigma-Aldrich X405 1% final
Trypan Blue stain 0.4% Molecular Probes T10282
Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) Gibco 25200-056
Tween-20 Sigma-Aldrich P2287 0.01% final

Riferimenti

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Luhr, M., Szalai, P., Engedal, N. The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay — A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (137), e57971, doi:10.3791/57971 (2018).

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