Laktatdehydrogenas kvarstad analysen — En enkel och tillförlitlig metod för att bestämma Bulk Autophagic kvarstad aktivitet i däggdjursceller
Summary
Här beskrivs ett enkelt och väl validerat protokoll för mätning av bulk autophagic kvarstad aktivitet i däggdjursceller. Metoden är baserad på kvantifiera andelen av laktatdehydrogenas (LDH) i sedimentable cell fraktioner jämfört med totala cellular LDH nivåer.
Abstract
Bulk autofagi kännetecknas av beläggs med stora delar av cytoplasman i dubbel/multi-membrane strukturer som kallas autophagosomes. Här beskrivs ett enkelt protokoll att övervaka denna process. Dessutom finns typiska resultat och experimentell validering av metoden autofagi-inducerande villkor i olika typer av odlade däggdjursceller. Under bulk autofagi binda autophagosomes cytosol, och därmed också lösliga cytosoliska proteiner, tillsammans med andra autophagic Last. LDH är en stabil och mycket riklig, lösligt cytosoliska enzym som är icke-selektivt binds till autophagosomes. Beloppet av LDH kvarstad avspeglar därför mängden bulk autophagic kvarstad. För att effektivt och korrekt avgöra LDH kvarstad i cellerna, anställer vi en electrodisruption-baserade fraktionering protokoll som effektivt separerar sedimentable från cytosoliska LDH, följt av mätning av enzymatisk aktivitet i sedimentable fraktioner kontra hela-cell prover. Autophagic kvarstad bestäms genom att subtrahera andelen av sedimentable LDH i obehandlad celler från det i behandlade celler. Fördelen med LDH kvarstad analysen är att det ger ett kvantitativt mått på den autophagic kvarstad av endogena Last, i motsats till andra metoder att antingen innebära ektopisk uttryck för kvarstad sonder eller semikvantitativt proteas skydd analyser av autofagi markörer eller receptorer.
Introduction
Autofagi (grekiska för ”äta själv”) är en evolutionärt bevarade process för vakuolär/lysosomal nedbrytning av intracellulära material. Vid upptäckt av de gener som autofagi-relaterade (”ATG”), som är viktiga för autofagi i jäst och människor, och insikten att autofagi spelar en betydande roll för människors hälsa och sjukdom (erkänt av 2016 Nobelpriset i medicin eller fysiologi till Yoshinori Ohsumi), autofagi har snabbt blivit en av de mest intensivt studerade processerna i cellbiologi1,2.
Macroautophagy (hädanefter benämnd ”autofagi”) är kännetecknas av expansion och vikning av intracellulära membran cisternae (”phagophores”) i förseglade, dubbel – eller multi – membrane strukturer (”autophagosomes”) som effektivt binda den omsluten material från resten av cytoplasman. Vid fusion av autophagosomes med lysosomer, är inre autophagosomal membranet och konfiskerade gods degraderad och återvinnas. Autophagosomes kan binda cytoplasmiska material i både slumpmässiga (icke-selektiva autofagi) och selektiv (selektiv autofagi) seder. Bulk autofagi sannolikt representerar en blandning av icke-selektiva och selektiva autofagi.
1960-och 70-talet (”morfologiska eran” av autofagi forskning) utvärderades främst autophagic kvarstad genom ultrastrukturella analyser. 1980-talet och början av 1990-talet (”den biokemiska eran”) Per Seglen och medarbetare – som studerat autofagi i primära råtta hepatocyter — utvecklade de första metoderna för att kvantitativt mäta autophagic kvarstad aktivitet3. Med dessa analyser, Seglen definieras och kännetecknas olika steg av autophagic-lysosomala väg4,5, upptäckte myntade de amphisome6 (produkten av endosome-autophagosome fusion) och var först att beskriva rollen av protein fosforylering i autofagi förordning7. Dock efter upptäckten av ATGs i 1990-talet (”den molekylära eran”) och den första karakteriseringen av ett däggdjur ATG8 protein, mikrotubuli-associerade protein 1A/1B-light kedja 3 (LC3) i 20008, användning av ATG proteiner som markörer för den autophagic process snabbt vunnit popularitet och de äldsta och mer arbetskrävande biokemiska metoderna var kvar. I själva verket under de senaste 18 åren, western blot och fluorescence mikroskopi analyser av LC3 har blivit den överlägset mest populära (och i många fall den enda) sätt att studera autofagi i däggdjursceller. Fördelen är den relativa lätthet med vilken dessa metoder kan utföras. Nackdelen är att man studerar en vagn komponent (LC3) snarare än faktiska autophagic Last. Detta är en ganska allvarlig nackdel, eftersom förhållandet mellan stater och/eller flux av LC3 via vägen kontra kvarstad och flux Last är mycket oklart. I själva verket har vi visat att merparten Last flux kan upprätthållas på höga nivåer under förhållanden där det finns ingen LC3 flux, trots närvaron av konjugerade LC3 i celler9. Dessutom visade vi att bulk autofagi är opåverkad av effektiv LC3 utarmning, och därmed sannolikt är LC3-oberoende9. Detta konstaterande har senare bekräftats av LC3 knock-out studier10,11, också ange att Parkin-beroende mitophagy (den selektiva autofagi av mitokondrier) är oberoende av LC310,11 .
Sammanfattningsvis, det finns ett klart behov för Last-baserade analyser att övervaka autophagic aktivitet. Optimalt bör sådana analyser vara brett tillämpliga, väldefinierade och enkelt att utföra. De senaste åren har vi tagit ett särskilt intresse för LDH kvarstad analysen, som utvecklades av Per Seglen i 1980-talet12, och bygger på att mäta överföringen av cytosoliska LDH till sedimentable, autophagic vakuol-innehållande cell fraktioner. LDH är en stabil, lösligt cytosoliska protein som är lätt Co binds när phagophores innesluta cytoplasmiska Last. Beslagtagande av LDH är därför en allmän åtgärd autophagic kvarstad. LDH bryts endast av de autophagic-lysosomala väg12. Således, i närvaro av lysosomal nedbrytning-hämmare, t.ex., bafilomycin A1 (Baf)13, experimentell behandlingseffekter direkt återspeglar förändringar i autophagic kvarstad aktivitet. I avsaknad av nedbrytning-hämmare, kan nettoeffekten av förändringar i LDH kvarstad och nedbrytning mätas.
LDH kvarstad analysen är i stort sett tillämplig, eftersom LDH uttrycks mycket och ubiquitously i alla celltyper och LDH nivåer kan kvantifieras korrekt av en enzymatisk analys14,15. Dock ursprungligen protokoll12 — etablerade i primära råtta hepatocyter — var ganska tidskrävande och krävs en stor mängd start material liksom en skräddarsydd elektrisk urladdning kondensator. I en stegvis sätt, har vi gradvis omvandlas analysen till en lätt och mångsidig metod. Första, ursprungliga protokollet var anpassad för användning i däggdjursceller linjerna16. Andra var metoden kraftigt nedskalad3,9. Tredje, flera steg i protokollet eliminerades, inklusive en mödosam densitet kudde steg17. Detta gjorde samtidigt en ytterligare nedskalning av metoden, från ursprungliga startpunkten för att använda en 10 cm platta per prov16 till att använda en enda brunn från en 12-well platta per prov (dvs.ungefär 15-fold mindre startas material)17. För det fjärde har identifierat vi en kommersiell elektroporation apparat som kan ersätta de skräddarsydda elektriska urladdning kondensator17.
Här presenteras våra senaste protokollet av LDH kvarstad analysen, vilket inkluderar vissa ytterligare förenklingar av metoden jämfört med den tidigare publicerade17 . Dessutom visas en uppsättning typiska resultat erhålls i ett antal olika celltyper, och ännu viktigare, flera rader med experimentell validering av metoden som använder farmakologiska samt genetiska knockdown och knockout metoder tillhandahålls. För en övergripande flödesschemat i hela protokollet, se figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammanfattningsvis utgör protokollet beskrivs här en tillförlitlig och allmänt tillämplig metod att följa bulk autophagic kvarstad i däggdjursceller. Jämfört med den ursprungliga metod12,16, har vi tagit bort ett antal onödiga steg, förenklad flera av de återstående stegen och introducerade en betydande nedskalning. Som ett resultat, protokollet förbättrad väsentligt i förhållande till kostnader – och tid-effektivitet, och samma mängd prover ka…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes ekonomiskt av Norges forskningsråd, Oslo universitet, Anders Jahre Foundation, Stiftelsen Nansen och arvet till minne av Henrik Homan. Vi tackar Dr. Noboru Mizushima för ATG5 +/ + MEFs och ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu för ATG7 +/ + MEFs och ATG7-/-MEFs och Dr Shizuo Akira för ATG9A +/ + MEFs och ATG9A-/-MEFs. Vi tackar Frank Sætre för tekniskt bistånd och Dr Per O. Seglen för konstruktiva metodologiska diskussioner.
Materials
| 1.5 ml and 2 ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 211-2130 and 211-2120 | |
| 12-well plates | Falcon | 353043 | |
| Accumax cell detachment solution | Innovative Cell Technologies | A7089 | Keep aliquots at -20 °C for years, and in fridge for a few months |
| Bafilomycin A1 | Enzo | BML-CM110-0100 | Dissolve in DMSO |
| BJ cells | ATCC | CRL-2522 | use at passage <30 |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 422361V | |
| Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658585 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | ThermoFisher Scientfic | C10228 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientfic | AMQAX1000 | |
| Cover glass for the Burker counting chamber | Fisher Scientific | 139-658586 | |
| Criterion Tris-HCl Gel, 4–20%, 26-well, 15 µl, 13.3 x 8.7 cm (W x L) | Bio-Rad | 3450034 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Earle's balanced salt solution (EBSS) | Gibco | 24010-043 | conatains 0.1% glucose |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E7889 | |
| Electroporation cuvette (4 mm) | Bio-Rad | 1652088 | |
| Exponential decay wave electroporator | BTX Harvard Apparatus | EMC 630 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | 10% final concentration in RPMI 1640 medium |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 56750 | Autoclave a 65 mM solution and keep in fridge for months |
| Incubator; Autoflow IR Direct Heat CO2 incubator | NuAire | NU-5510E | |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | ThermoFisher | 13778150 | |
| LNCaP cells | ATCC | CRL-1740 | use at passage <30 |
| 3-Methyl Adenine (3MA) | Sigma-Aldrich | M9281 | Stock 100 mM in RPMI in -20 °C. Heat stock to 65 °C for 10 minutes, and use at 10 mM final concentration |
| Refridgerated Microcentrifuge | Beckman Coulter Life Sciences | 368831 | |
| Refridgerated Microcentrifuge with soft-mode function | Eppendorf | Eppendorf 5417R | |
| MRT67307 hydrochloride (ULKi) | Sigma-Aldrich | SML0702 | Inhibits ULK kinase activity. Dissolve in DMSO. |
| MaxMat Multianalyzer instrument | Erba Diagnostics | PL-II | |
| MCF7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| NADH | Merck-Millipore | 1.24644.001 | |
| Nycodenz | Axis-Shield | 1002424 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | ThermoFisher | 31985062 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012-019 | |
| Pipette tips 3 (0.5-20 µl) | VWR | 732-2223 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (1-200 µl) | VWR | 732-2207 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipette tips (100-1000µl) | VWR | 732-2355 | Thermo Fischer ART Barrier tips |
| Pipettes | ThermoFisher | 4701070 | Finnpipette F2 GLP Kit |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407-10X5MG | Make a 1 mg/ml stock solution in sterile H2O. This solution is stable at -20 °C for at least 1 year. |
| Pyruvate | Merck-Millipore | 1066190050 | |
| RPE-1 cells (hTERT RPE-1) | ATCC | CRL-4000 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875-037 | |
| SAR-405 | ApexBio | A8883 | Inhibits phosphoinositide 3-kinase class III (PIK3C3). Dissolve in DMSO. |
| Silencer Select Negative Control #1 (siCtrl) | ThermoFisher/Ambion | 4390843 | |
| Silencer Select ATG9-targeting siRNA (siATG9A) | ThermoFisher/Ambion | s35504 | |
| Silencer Select FIP200-targeting siRNA (siFIP200) | ThermoFisher/Ambion | s18995 | |
| Silencer Select ULK1-targeting siRNA (siULK1) | ThermoFisher/Ambion | s15964 | |
| Silencer Select ULK2-targeting siRNA (siULK2) | ThermoFisher/Ambion | s18705 | |
| Silencer Select GABARAP-targeting siRNA (siGABARAP) | ThermoFisher/Ambion | s22362 | |
| Silencer Select GABARAPL1-targeting siRNA (siGABARAPL1) | ThermoFisher/Ambion | s24333 | |
| Silencer Select GABARAPL2-targeting siRNA (siGABARAPL2) | ThermoFisher/Ambion | s22387 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate (NaH2PO4 • 2H2O) | Merck-Millipore | 1.06580.1000 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (Na2HPO4 • 2H2O ) | Prolabo | 28014.291 | |
| Sucrose | VWR | 443816T | 10% final concentration in water; filter through 0.45 µm filter and keep in fridge for months |
| Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Inhibits the SERCA ER Ca2+ pump. Dissolve in DMSO. |
| Triton X-405 | Sigma-Aldrich | X405 | 1% final |
| Trypan Blue stain 0.4% | Molecular Probes | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25% w/v Trypsin) | Gibco | 25200-056 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | 0.01% final |
Riferimenti
- Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi’s Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
- Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
- Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
- Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
- Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
- Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
- Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, 633-636 (1992).
- Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
- Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
- Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
- Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
- Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
- Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
- Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
- Bergmeyer, H. U., Bernt, E., Bergmeyer, H. U. . Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). 2, 574-579 (1974).
- Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
- Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
- Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
- Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
- Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
- Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
- Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
- Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
- Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
- Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
- Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
- Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
- Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
- An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
- Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
- Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
- Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
- Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
- Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
- Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
- Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
- Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
- Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836 (2018).
- Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
- Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
- Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
- Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
- Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).
