Questo articolo presenta un metodo basato sull'accoppiamento per facilitare la proiezione di sovraespressione nel lievito gemmante utilizzando una libreria di plasmide disposti.
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Articolo metodologico
Sovraespressione di accoppiamento-based Library Screening in lievito
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lievito è stato ampiamente utilizzato come modello nello studio di proteine associate a malattie umane. Lo screening genetico del genoma è un potente strumento comunemente utilizzato negli studi di lievito. L'espressione di un numero di proteine associate malattia di neurodegenerative in lievito causa citotossicità e formazione aggregata, ricapitolare i risultati osservati in pazienti con questi disturbi. Qui, descriviamo un metodo per lo screening di un modello di lievito della sclerosi laterale amiotrofica-associati proteina FUS per i modificatori della sua tossicità. Invece di utilizzare la trasformazione, questa nuova piattaforma di screening si basa sull'accoppiamento di lievito per introdurre una libreria disposte dei plasmidi nel modello del lievito. Il metodo di accoppiamento ha due vantaggi: in primo luogo, è altamente efficiente; in secondo luogo, la libreria allinearono pre-trasformata dei plasmidi possa essere memorizzata per a lungo termine come uno stock di glicerolo e rapidamente applicata agli altri schermi senza il passaggio di alta intensità di lavoro di trasformazione nel modello del lievito ogni volta. Dimostriamo come questo metodo può essere utilizzato con successo per geni che modificano la tossicità del FUS.
Introduzione
Il lievito Saccharomyces cerevisiae è stato ampiamente usato nella ricerca scientifica di base1 di comprendere processi cellulari direttamente correlati alle malattie umane. Inoltre, è stato utilizzato come organismo modello per lo studio di proteine umane di malattia-collegati, come quelli legati a malattie neurodegenerative più comuni, tra cui il morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, malattia di Huntington e amiotrofica Sclerosi laterale (ALS)2. Un vantaggio del modello del lievito è la facilità con cui può essere eseguita una schermata di genoma per identificare vie cellulari correlate alla tossicità delle ....
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Protocollo
Nota: Il protocollo descritto qui è stato progettato per lo screening di plasmidi libreria contenute in dieci piastre da 96 pozzetti ma può essere scalato verso l'alto o verso il basso di conseguenza. Il protocollo deve essere ripetuta per completare lo screening di tutta la libreria. Di solito, lo screening contro 10 piastre di geni libreria ogni volta che può essere gestito comodamente da 1 persona.
1. preparazione per la trasformazione del lievito di 96 pozzetti
Nota: Questo passaggio viene eseguito come in precedenza descritto7,10.
- Aliquotare e 5 µ l (circa 50 –....
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Risultati
L'ALS-collegato della proteina FUS, una proteina legante RNA/DNA, precedentemente è stata studiata in lievito aploidi7,8. Utilizzando la selezione genetica del metodo basato sulla trasformazione scoperto parecchi geni di lievito che sopprimono la tossicità FUS. L'omologo umano di uno dei geni di lievito più successivamente è stato dimostrato per essere efficace a sopprimere la tossicità in una primaria delle cellule di un neurone .......
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Discussione
Qui, descriviamo un protocollo per eseguire una schermata di sovraespressione di plasmide in lievito mediante accoppiamento per introdurre la libreria di plasmide nel modello del lievito. Utilizzando questo approccio, più modelli di lievito della tossicità delle proteine malattia neurodegenerative possono essere selezionate utilizzando la stessa raccolta di lievito trasformata con una libreria di plasmide. Solo il laborioso processo di trasformazione deve essere eseguita una volta, dopo quale lievito altamente efficiente.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati per la premurose discussioni con i membri del laboratorio Ju e laboratorio di Zhong e il sostegno finanziario da Wright State University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| salmone sperma DNA (SS-DNA) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| YPD brodo | Research Products International (RPI) | Y20090 | |
| Agar Fisher granulato | Sci BP97445 | ||
| D-(+)-Glucose | Research Products International (RPI) | G32040 | |
| D-(+)-Galactose | Research Products International (RPI) | G33000 | |
| D-(+)-Raffinosio Pentahydrate | Research Products Internazionale (RPI) | R20500 | |
| Solfato di ammonio | Fisher Sci | A702-500 | |
| Sintetico Ura- drop out medium | Clontech | 630416 | |
| Integratore di aminoacidi di lievito -Istidina / -Uracil | Clontech | 630422 | |
| Lievito base di azoto senza aminoacidi e solfato di ammonio | Research Products International (RPI) | Y20060 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Fisher Sci | S67496 | |
| Acetato di litio, anidro | Fisher Sci | AC268640010 | |
| Polietilenglicole 3350 (PEG-3350) | Spettro chimico | PO125-12KG | |
| Replicatore a 96 pin | Scinomix | SCI-5010-OS | |
| Nunc OmniTray | Thermo Sci | 140156 | |
| Corning Costar Piastra per test a 96 pozzetti, fondo rotondo con coperchio | Fisher Sci | 07-200-760 | non trattato, sterile |
| Eppendorf Research plus Pipetta multicanale | Eppendorf | TI13690052 | 30-300ul volume |
| Fisherbrand Isotemp Bagni a secco digitali/Riscaldatori a blocchi | Fisher Sci | 88-860-023 | |
| Eppendorf MixMate | Eppendorf | 21-379-00 | |
| Eppendorf 5810R Centrifuga | Fisher Sci | 05-413-112 | |
| Centrifuga Avanti J-26 XPI | Beckman | 393127 | |
| MultiFlo FX Dispenser multimodale | BioTek | ||
| Rotore HDA | Strumenti |
Riferimenti
- Dujon, B. A., Louis, E. J. Genome diversity and evolution in the budding yeasts (Saccharomycotina). Genetics. 206 (2), 717-750 (2017).
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's ye....
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Ristampe e permessi
