小鼠原代多元体的体外模拟？
Summary
这项技术的目的是准备一种高度丰富的来自小鼠脊髓的原发运动神经元 (mns) 培养。为了评估引起 mn 疾病的突变的后果, 我们在这里描述了这些孤立的 m2 的隔离和它们通过磁光的转染。
Abstract
脊髓运动神经元 (mns) 的神经退行性变与大量的神经疾病有关, 包括肌萎缩侧索硬化症、夏科-玛丽-牙齿疾病和脊髓肌肉萎缩, 这些疾病都与肌肉萎缩有关。脊髓 mns 的初级培养已被广泛用于证明特定基因在这类疾病中的参与, 并描述其突变的细胞后果。该协议模拟了一种源自亨德森和他的同事们20多年前的开创性工作的主要 mn 文化。首先, 我们详细介绍了一种从小鼠胚胎中解剖脊髓前角并使用密度梯度从邻近细胞中分离 ms 的方法。然后, 我们提出了一种利用磁光法高效地转换具有表达质粒的 mns 的新方法。最后, 我们说明了如何固定和免疫控制原发性 mns. 利用导致夏科-玛丽-牙齿疾病2型的神经纤维突变, 该协议演示了一种定性的方法来表达感兴趣的蛋白质, 并研究它们的参与mn 的生长、维护和生存。
Introduction
神经肌肉疾病包括各种临床和基因上不同的疾病, 其特点是肌肉和/或神经系统的改变。由于测序技术的进步, 在过去十年中发现了数百种导致这些罕见疾病的基因 (可在神经肌肉疾病中心查阅的名单, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html)。识别突变的多样性表明, 单个基因中的不同突变会导致不同的表型和疾病1、2、3,不同基因的突变会产生相似的表型4 个,5. 在这方面, 正在努力开发能够成为分析突变后果和病理机制的有力工具的细胞模型。
脊髓 mns 有一个大的 somas 位于脊髓的腹侧角, 形成长轴突, 以骨骼肌纤维为目标, 并允许自愿运动, 通过释放乙酰胆碱在神经肌肉交界处。由于 mns 受到肌萎缩侧索硬化症、夏科-玛丽-牙齿疾病 (cmt) 和脊髓肌肉萎缩等神经肌肉疾病的影响, 亨德森博士和他的同事们制定了第一个方案6 , 允许种植体外脊髓 mns 和神经营养因子 gdnf7 (胶质细胞衍生的神经营养因子) 的发现。自那时以来, 技术改进使脊柱 mnm及其亚型能够使用几十年化骨联8进行更准确的纯化, 但密度梯度的浓缩仍然很强大, 并在目前与初级脊柱 mns 合作的实验室中得到广泛使用9,10,11,12,13,14. 随后, 还可以利用表面标记 p75(ntr)15、16、17, 通过免疫调节获得更高的 mn 纯化级。
脊髓包含不同类型的颈椎, 胸椎, 腰椎 m2, 以及中位和侧向运动柱, 不同的位置在前角的背腹轴和目标之间, 他们支配 8,18. 初级 mn 培养可以按生理比例恢复所有这些 mn 亚型。这种技术的主要局限性是在程序结束时获得的 mb 数量少;事实上, 它可以预期从六个胚胎中获得大约10个 5个ms, 这适用于显微镜, 但限制了生物化学实验。为了对更标准化的亚型和丰富的 ms (& gt;106细胞) 进行实验, 胚胎干细胞衍生的 ms 应被考虑到 18。
将野生类型突变基因转染或将内源基因分解为初级 mms 是破译生理病理途径的一种快速而有益的工具, 尤其是在没有小鼠模型的情况下。磁染是一种转染原代神经元的技术, 类似于没有相关神经毒性的脂切。此外, 转染可以在成熟的神经元进行几天后, 在体外, 不同于基于电穿孔9的技术。然而, 这种技术的一个缺点是, 珠子结合核酸的培养, 造成噪音的 dapi 标签。病毒感染可能是最有效的转染 mn 的技术;然而, 磁光化不需要病毒生产和细胞感染所需的某些安全程序。
Protocol
所有涉及动物的程序都被该机构的道德委员会接受。 1. 解决方案准备 在 l-15 培养基中制备 4% bsa 透析的10毫升。 将牛血清白蛋白粉在 l-15 培养基10毫升中, 以 4% (w/v) 的速度溶解。 将溶液添加到20毫升的透析盒式磁带上, 并提供 20 kda 截止。在4°c 搅拌下, 对 l-15 培养基的500毫升进行透析3天。每天更换 l-15 介质。 通过0.22μm 膜过滤溶液, 并在 15 ml 管?…
Representative Results
在培养24小时后, 运动神经元 (mn) 应该已经显示出显著的轴突生长 (至少比 soma 大小长 6倍)。在接下来的几天里, 轴突应该继续生长并显示分支 (图 2)。由于子类型的特殊性, 会有不同的形态。例如, 神经性轴向肌肉的中位柱 mn 比侧向运动柱 mn 具有更短和更多的分支轴突, 而侧向运动柱 mn 则为支配肢体肌肉18。 <p class="jove_content" fo:ke…
Discussion
该协议的关键点之一是, 在开发过程中, 在精确的时间窗口 (e12.5) 对小鼠胚胎进行解剖, 以优化最终获得的 mn 量。此外, 为了获得最佳产量, 解剖应在上午或下午早些时候进行。在 e12.5 之前 (例如e11.5), 解剖是困难的, 特别是在消除脑膜方面。e12.5 后, 获得的 m2 数量显著下降。为了控制胚胎发育阶段, 成年女性和男性在一天结束时首先被放在一起。第二天早上, 成年人被分开, 女性被检查是否有?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢 “神经发展发展协会” 感谢 jacquier 博士的研究金和 afm-telete通通过 myneuralp 战略计划提供的支持。我们还要感谢克里斯·亨德森博士、威廉·卡穆博士、布里吉特·佩特曼博士、塞德里克·拉乌尔博士和乔治·海斯博士, 他们参与开发和改进了这项技术, 并传播了他们的知识。
Materials
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Jacquier, A., Risson, V., Schaeffer, L. Modeling Charcot-Marie-Tooth Disease In Vitro by Transfecting Mouse Primary Motoneurons. J. Vis. Exp. (143), e57988, doi:10.3791/57988 (2019).