Doença de Charcot-Marie-Tooth In Vitro de modelagem por Transfecting Mouse motoneurônios primários
Summary
O objetivo desta técnica é preparar uma cultura altamente enriquecida de motoneurônios primários (MNs) de murino da medula espinhal. Para avaliar as consequências das mutações causadoras de doenças MN, descrevemos aqui o isolamento destes isolados MNs e seu transfeccao por magnetofection.
Abstract
Neurodegeneração de motoneurônios da coluna vertebral (MNs) está implicada em um grande espectro de doenças neurológicas, incluindo a esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth e atrofia muscular espinhal, que são todos associados com atrofia muscular. Culturas primárias de MNs espinhais têm sido usadas amplamente para demonstrar o envolvimento de genes específicos em tais doenças e caracterizar as consequências celulares de suas mutações. Esta cultura de modelos um primário MN protocolo derivada do trabalho seminal de Henderson e colegas há mais de vinte anos. Primeiro, detalhamos um método de dissecar os cornos anteriores da medula espinhal de um embrião de rato e isolando os MNs de vizinhas células usando um gradiente de densidade. Em seguida, apresentamos uma nova forma de forma eficiente transfecting MNs com plasmídeo de expressão usando magnetofection. Finalmente, ilustramos como corrigir e delgados primário que MNS. usando mutações de Neurofilamento que causam a doença de Charcot-Marie-Tooth tipo 2, este protocolo demonstra uma abordagem qualitativa para expressar proteínas de interesse e estudar o seu envolvimento em Crescimento de MN, manutenção e sobrevivência.
Introduction
Doenças neuromusculares englobam uma variedade de patologias clinicamente e geneticamente distintas que caracterizam-se pela alteração do músculo e/ou o sistema nervoso. Devido aos avanços nas tecnologias de sequenciamento, centenas de genes responsáveis por estas doenças raras foram identificadas durante a última década (lista disponível no centro de doença Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). A variedade de mutações identificadas indica que diferentes mutações em um único gene podem causar diferentes fenótipos e doenças1,2,3 e que mutações em genes diferentes podem produzir fenótipos similares 4 , 5. neste contexto, há esforços para desenvolver modelos de celulares que podem se tornar poderosas ferramentas para analisar as consequências de mutação e mecanismos patológicos.
MNs espinhais tem grandes somas localizados nos cornos ventrais da medula espinhal, axônios longos de formulário de fibras musculares esqueléticas de destino e permitir movimentos voluntários através da liberação de acetilcolina na junção neuromuscular. Desde MNs são afetados por doenças neuromusculares como esclerose lateral amiotrófica, doença de Charcot-Marie-Tooth (CMT), e atrofia muscular espinhal, Dr. Henderson e colegas desenvolveram o primeiro protocolo6 permitidos para cultivo de in vitro MNs da coluna vertebral e a descoberta de neurotrophic factor GDNF7 (fator neurotrófico derivado de célula glial). Refinamentos técnicos desde então têm permitido para purificação mais precisa de MNs da coluna vertebral e seus subtipos usando FACS8, mas o enriquecimento por gradiente de densidade permanece poderosa e amplamente utilizado em laboratórios, atualmente trabalhando com MNs espinhais primários 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14. posteriormente, também é possível obter um maior grau de purificação MN através de immunopanning, tirando proveito do marcador de superfície p75(NTR)15,16,17.
A medula espinhal contém diferentes subtipos de MNs cervicais, torácicas e lombares, bem como medianos e laterais motor as colunas que diferem entre sua localização no Corno anterior em um eixo dorso-ventral e entre os alvos que eles inervam8, 18. culturas primárias MN podem recuperar todos esses subtipos de MN em proporções fisiológicas. A principal limitação dessa técnica é o baixo número de MNs obtidos ao final do procedimento; na verdade, pode presumir-se obter em torno de 105 MNs de seis embriões, que é apropriada para a microscopia, mas limitando para experimentos de bioquímica. A realizar experimentos com mais padronizados subtipos e MNs abundantes (> 106 células), embrionárias MNs de células-tronco derivadas devem ser considerados18.
Transfection do selvagem-tipo/mutante transgenes ou knockdown genes endógenos em MNs primários é uma ferramenta rápida e útil para decifrar vias fisiopatológicas, especialmente quando modelos de rato não estão disponíveis. Magnetofection é uma técnica para transfecting os neurônios primários, semelhantes ao lipofection sem a neurotoxicidade relacionada. Além disso, transfecção pode ser executada em neurônios maduros depois de vários dias em vitro, ao contrário de técnicas baseadas em electroporation9. No entanto, uma desvantagem dessa técnica é que os grânulos ligam a ácidos nucleicos na cultura, causando barulho na rotulagem de DAPI. Infecção viral é provavelmente a técnica mais eficiente para MNs transfecting; no entanto, magnetofection não requer determinados procedimentos de segurança necessários para a produção viral e infecção celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um dos pontos críticos no presente protocolo é que os embriões de rato são dissecados em uma janela de tempo preciso durante o desenvolvimento (E12.5) para otimizar a quantidade de MNs obtidos no final. Além disso, para um rendimento ideal, a dissecação deve ser realizada pela manhã ou no início da tarde. Antes de E12.5 (por exemplo, em E11.5), a dissecação é difícil, principalmente no que tange a eliminação das meninges. Depois de E12.5, o número de MNs obtidos cai significativamente. Para contr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a “Association pour le développement de la neurogénétique” para comunhão e AFM-Teleton do Dr. Jacquier seu apoio através do plano estratégico de MyoNeurAlp. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul e Dr. Georg Haase, que participaram de desenvolver e melhorar a técnica e difundir seus conhecimentos.
Materials
| Material | |||
| Silicone dissection dish | Living systems instrumentation | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| round coverslip | NeuVitro, Knittel glass | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer cassettes | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20,000 MWCO ; 30 mL |
| Filter unit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Syringe Filters | Millipore | SLGP033RS | |
| 4 well plate | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta treated plate |
| forceps | FST by Dumont | 11252-20 | #5 forceps |
| scissor | FST by Dumont | 14060-10 | fine scissors |
| scalpel | FST by Dumont | 10035-20 | curved blade |
| scalpel | FST by Dumont | 10316-14 | micro-knife scalpel |
| Petri dish | Greiner | 663102 | ø x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL polypropylene tube | Falcon | 352096 | |
| filter paper | Watman | 1001125 | circle, 125 mm diameter |
| glass chamber slide | Lab-Tek | 154526 | 4 chambers |
| Plasmid pCAGEN | Addgene | #11160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and mediums | |||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 medium, no red phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithine | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| trypsin 2.5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS w/o Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | without Mg2+ Ca2+ |
| sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron cell culture medium | ThermoFisher Scientific | A3582901 | Neurobasal Plus medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES buffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Density gradiant medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| supplement medium | ThermoFisher Scientific | A3582801 | B-27 Plus |
| Horse serum heat inactivated | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| penicilline/streptomycine | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immuno fluorescence | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | without Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normal goat serum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Choline Acetyl Transferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H non phosphorylated (SMI32) | Biolegends | SMI-32P | IF at 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 tubulin (Tuj1 clone) | Biolegends | 801201 | IF at 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF at 1/200 |
Riferimenti
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