大鼠体内部分肝工程的外科技术基础
Summary
建立了大鼠体内单肝叶灌注模型的新手术技术, 为今后进一步研究活体部分肝工程提供了前提条件。
Abstract
器官工程学是一种新的策略来产生肝脏器官替代品, 可能被用于移植。最近,体内肝脏工程, 包括体内器官去细胞后重写, 已成为一个有希望的方法, 在体外肝工程。然而, 术后生存没有实现。本研究旨在研制一种新的大鼠体内选择性肝叶灌注手术技术, 作为体内肝脏工程的前提条件。我们只通过左外侧叶产生电路旁路。然后左侧叶血气生理盐水灌注。实验以4组 (每组n = 3 只鼠) 为基础, 不同的灌注时间为20分钟、2小时、3小时和 4 h. 生存, 以及在宏观上可见变化的颜色和组织学上确定的血细胞缺乏门户三合会和正弦波, 被作为一个成功的模型建立的指标。左外侧叶选择性灌注后, 我们观察到左外侧叶确实由红色转为淡黄色。在组织学评估中, 在门静脉、中心静脉和正弦波的分支中没有血细胞可见。左外侧叶在重新打开被阻断的血管后变红。12/12 只老鼠在手术中存活了一个多星期。我们是第一个报告一个手术模式的活体单肝叶灌注与长期生存期超过一周。与先前发表的报告相反, 这里提出的技术最重要的优点是在整个过程中保持70% 的肝脏灌注。该技术的建立为大鼠体内部分肝工程提供了基础, 包括去细胞和 recellularization。
Introduction
器官移植的适应症不断扩大。相比之下, 器官捐献率和器官整体质量正在下降, 导致对移植物的需求增加。在肝脏移植等待名单中增加的候选人数继续增加 (例如, 在美国, 2016年增加了11340名患者, 与2015年的10636相比)1。尽管作出了大量努力, 但现有器官的数量并不满足临床需要。由于肝病发病率的增加, 许多终末期肝病患者死于移植等待名单, 在捐赠器官成为可利用之前。为满足对供肝移植的巨大需求, 目前正在积极推行采用肝组织工程原理的替代方法2。目前, 一种新研制的肝脏工程生物技术有可能克服这一不足。
肝脏工程由两个步骤组成: 一个脱细胞支架的产生, 其次是支架的重写。为了获得生物脱细胞肝支架, 说明肝通过血管系统灌注离子或非离子洗涤剂, 可以去除肝脏中的细胞材料。在以往的大多数研究中, 用 TritonX100 钠和月桂酸盐联合灌注肝脏, 实现了一种生物脱细胞肝支架。因此, 所有细胞都被移除, 而细胞外基质的结构得以维持。reseeded 的器官支架与成熟细胞、肝细胞以及内皮细胞系和原发肝细胞有或不同时应用内皮细胞或间充质干细胞 (MSC)。大多数研究人员专注于体外肝脏工程3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14。然而, 在以前的研究中, 只有小块的填充支架立方体被移植到不同的异位植入部位。在一些研究中, 部分填充支架移植为辅助移植。然而, 最大报告的生存时间只有72小时8,14。据我们所知, 填充全肝移植的原位移植尚未进行或发表。工程器官的长期功能和移植仍处于起步阶段。因此, 需要另一种方法来进行活体肝脏工程。
在活体肝工程中, 可能是在生理条件下研究肝重写的一种替代方法。与体外肝工程相比, 体内肝脏工程的优越性是多方面的。体外填充部分肝支架采用适当的温度、充足的氧、养分和生长因子与人工培养基进行体外灌注对比, 进行生理血液灌注。此外, 其余部分正常肝脏维持肝功能, 主要允许长期生存。由于植入的体外工程肝移植仍然无法维持实验动物的长期生存, 其肝功能8, 我们设想在体内部分肝 engineeringwould 最终成为一个有前景的模型, 以进一步研究工程肝的进化与更长的生存观察比体内。
最近, 一个研究小组 (潘和同事) 首次提出了在体内肝脏工程的技术15。尽管解剖和技术上的挑战, 他们实现了活体大鼠右下肝叶的分离灌注。他们报告了在体内重写使用大鼠原发性肝细胞系的第一个术中结果。然而,在体内手术灌注模型的 Pan等。有缺点。他们以完全阻断门静脉和下腔静脉为代价, 在大鼠中实现单肝叶灌注, 可能对动物造成严重损害。实验鼠仅在术中观察时间6小时后牺牲。因此,体内肝叶灌注技术需要进一步改善, 才能实现术后生存。
我们开发了一种新的活体肝叶灌注生存模型, 根据前人对16大鼠肝脏解剖的研究, 门静脉插管技术在小鼠17的血流动力学监测和肝脏生物工程18,19. 程序的关键步骤见图 1A – 1E。
该技术适用于那些想使用本实验的活体灌注模型, 用于药物输液部分器官治疗的基础研究,体内去细胞作为器官疾病的化学切除术 (如:, 肝癌),体内细胞培养中的瓣膜基质比较了体外二维和三维细胞培养系统20、21、22、23,24,25,26、在活体肝工程中由去细胞和重写。
Protocol
Representative Results
Discussion
通过阻断和 cannulating 左门静脉与导管作为流体入口和左外侧肝静脉与另一个导管作为液体出口, 我们成功地产生了体内液体旁路在左外侧叶, 表明虽然该技术是非常具有挑战性的, 由于导管的体积小, 造成出血的高风险, 这是可行的。即使是长时间灌注4小时的老鼠至少存活了1周, 表明大鼠可以忍受这种手术过程。
在下一节中, 我们描述了三技术上最困难和最关键的步骤, ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢耶拿大学医院解剖学研究所的 Geiling, 以制作大鼠肝脏解剖示意图。
Materials
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon | ||
Riferimenti
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
