Una nuova tecnica chirurgica come una Fondazione per In Vivo parziale ingegneria del fegato nel ratto
Summary
Stabiliamo una nuova tecnica chirurgica per un modello di aspersione del singolo lobo del fegato in vivo nel ratto come prerequisito per ulteriormente lo Studio in vivo fegato parziale Ingegneria in futuro.
Abstract
Ingegneria dell’organo è una nuova strategia per generare sostituti di organo del fegato che possono essere potenzialmente utilizzati nel trapianto. Recentemente, in vivo del fegato di ingegneria, compreso in vivo decellularizzazione organo seguita da ripopolamento, è emerso come un promettente approccio sopra ingegneria ex vivo del fegato. Tuttavia, la sopravvivenza postoperatoria non è stata realizzata. Lo scopo di questo studio è quello di sviluppare una nuova tecnica chirurgica di in vivo aspersione selettiva lobo del fegato in ratti come prerequisito per l’ingegneria in vivo del fegato. Generiamo un circuito di bypass solo attraverso il lobo laterale sinistro. Quindi, lobo laterale sinistra è irrorato con soluzione fisiologica eparinizzata. L’esperimento è eseguito con 4 gruppi (n = 3 ratti per gruppo) basato su tempi diversi aspersione di 20 min, 2h, 3h e 4h. sopravvivenza, come pure il cambiamento in modo macroscopico visibile di colore e istologicamente determinato assenza di cellule del sangue nella triade portale e i sinusoids, è considerato un indicatore per una struttura di modello di successo. Dopo aspersione selettiva del lobo laterale sinistro, osserviamo che il lobo laterale sinistra, infatti, trasformato da rosso a giallo debole. In una valutazione istologica, non le cellule del sangue sono visibili nel ramo della vena portale, la vena centrale e sinusoidi. Il lobo laterale sinistro diventa rosso dopo la riapertura dei vasi bloccati. 12/12 ratti è sopravvissuto la procedura per più di una settimana. Siamo i primi a segnalare un modello chirurgico per in vivo di aspersione singolo lobo del fegato con un periodo di sopravvivenza lunga di più di una settimana. In contrasto con il rapporto precedentemente pubblicato, il vantaggio più importante della tecnica presentata qui è che l’aspersione del 70% del fegato è mantenuto durante tutta la procedura. L’istituzione di questa tecnica fornisce una base per in vivo parziale ingegneria del fegato in ratti, tra cui decellularizzazione e ricellularizzazione.
Introduction
Le indicazioni per trapianto dell’organo sono in continua espansione. Al contrario, tassi di donazione di organi e la qualità complessiva degli organi sono in declino, che conduce ad una crescente domanda per gli innesti. Il numero di candidati aggiunto alla lista d’attesa di trapianto di fegato ha continuato ad aumentare (ad es., negli Stati Uniti, 11.340 pazienti sono stati aggiunti nel 2016, confrontato con 10.636 nel 2015)1. Nonostante i notevoli sforzi, il numero di organi disponibili non soddisfa le esigenze cliniche. A causa dell’incidenza aumentata di malattia epatica, molti pazienti con stadio finale muore di malattie del fegato in lista d’attesa di trapianto prima di un organo del donatore diventa disponibile. Per soddisfare l’enorme richiesta di innesti di fegato da donatore, approcci alternativi usando il tessuto del fegato, principi di ingegneria sono stati attivamente perseguito2. Al giorno d’oggi, una nuova concezione tecnica biologica di ingegneria del fegato potrebbe potenzialmente superare questa carenza.
Ingegneria del fegato è costituito da due passaggi: la generazione di un’impalcatura acellulare, seguita da un ripopolamento dell’impalcatura. Per ottenere un’impalcatura del fegato acellulare biologica, il fegato espiantato è irrorato tramite il sistema vascolare con detergenti ionici e non ionici, in grado di rimuovere il materiale cellulare dal fegato. Nella maggior parte degli studi precedente, un’impalcatura di fegato acellulare biologica è stata realizzata tramite aspersione del fegato con una combinazione di solfato dodecilico di sodio e TritonX100. Di conseguenza, tutte le cellule sono state rimosse, mentre è stata mantenuta la struttura della matrice extracellulare. I ponteggi di organo erano reseeding con cellule mature, danno epatocellulare, nonché linee di cellule endoteliali ed epatociti primari con o senza l’applicazione simultanea di cellule endoteliali o cellule staminali mesenchimali (MSC). Maggior parte dei focus di ricercatori sulla ex vivo del fegato ingegneria3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Tuttavia, nella maggior parte degli studi precedente, solo piccoli pezzi di cubi ripopolato patibolo sono stati trapiantati in siti di impianto heterotopic differenti. In alcuni studi, impalcature ripopolate parziale sono state trapiantate come un innesto ausiliario. Tuttavia, il tempo di sopravvivenza massima segnalata era solo 72 h8,14. Per quanto ne sappiamo, trapianto ortotopico di un innesto completo del fegato ripopolato non ancora è stato eseguito o pubblicato su. La funzione a lungo termine e il trapianto di organi ingegnerizzati sono ancora nella loro infanzia. Pertanto, è necessario un approccio alternativo all’ingegneria ex vivo del fegato.
In vivo del fegato ingegneria può rappresentare un’alternativa per lo studio di ripopolamento epatico in condizioni fisiologiche. I vantaggi dell’ingegneria in vivo del fegato rispetto all’ ex vivo del fegato ingegneria sono molteplici. L’impalcatura parziale del fegato in vivo ripopolata è sottoposto alla perfusione fisiologico del sangue con temperatura adeguata, sufficiente ossigeno, sostanze nutritive e fattori di crescita in contrasto con ex vivo aspersione con terreno di coltura artificiale. Inoltre, il rimanente fegato normale parziale mantiene la funzione epatica, principalmente permettendo la sopravvivenza a lungo termine. Poiché un impiantato ex vivo progettato dell’innesto del fegato è ancora incapace di sostenere la sopravvivenza a lungo termine degli animali da esperimento tramite la funzione epatica8, immaginiamo che in vivo parziale del fegato engineeringwould diventare in definitiva un modello promettente per approfondire ulteriormente l’evoluzione dei fegati ingegnerizzati con osservazioni di sopravvivenza più lunghe rispetto ex vivo.
Recentemente, un gruppo di ricerca (Pan e colleghi) ha presentato, per la prima volta, una tecnica di fegato in vivo 15di ingegneria. Hanno raggiunto l’aspersione isolata del lobo inferiore di destra del fegato in ratti viventi nonostante sfide Anatomiche e tecniche. Hanno riferito i primi risultati intraoperative di ripopolamento in vivo utilizzando una linea cellulare degli epatociti primari di ratto. Tuttavia, il modello di aspersione chirurgica in vivo di Pan et al. ha svantaggi. Hanno raggiunto la perfusione di singolo lobo del fegato in ratti a scapito di bloccare completamente la vena portale e la vena cava inferiore, che può causare gravi danni all’animale. I ratti sperimentali sono stati sacrificati dopo solo 6 ore di tempo di osservazione intraoperatoria. Pertanto, la tecnica di aspersione del lobo del fegato in vivo ha bisogno di ulteriore miglioramento ai fini della sopravvivenza postoperatoria.
Abbiamo sviluppato un modello di sopravvivenza romanzo per in vivo di aspersione lobo del fegato, sulla base di precedenti studi di anatomia epatica del ratto16, la tecnica di inserimento di una canula della vena portale per il monitoraggio emodinamico in topi17e Bioingegneria del fegato 18 , 19. i passaggi principali per la procedura sono illustrati in Figura 1A – 1E.
Questa tecnica è adatta per chi desidera utilizzare questo modello sperimentale in vivo di aspersione per ricerca di base sul trattamento parziale dell’organo da infusione con le droghe, in vivo decellularizzazione come una resezione chimica per le malattie dell’organo (per esempio. , cancro del fegato), in vivo coltura cellulare in una matrice decellularizzata confrontando ex vivo bidimensionale e tridimensionale delle cellule cultura sistemi20,21,22,23 , 24 , 25 , 26e in vivo del fegato di ingegneria di decellularizzazione e ripopolamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bloccando e incannulamento sinistro della vena con un catetere come un fluido in entrata e la vena epatica laterale sinistra con un altro catetere come un fluido in uscita, abbiamo generato con successo un bypass in vivo fluido all’interno del lobo laterale sinistro, che indica che anche se la tecnica è altamente impegnativa a causa le piccole dimensioni dei vasi per inserimento di una canula e un elevato rischio di sanguinamento, è fattibile. Perfino i ratti sottoposti a un periodo lungo di aspersione di 4 or…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Jens Geiling dall’Istituto di anatomia I, ospedale universitario di Jena, per produrre i disegni schematici di anatomia del fegato del ratto.
Materials
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon | ||
Riferimenti
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
