En kirurgiske teknikken som grunnlag for i Vivo delvis leveren Engineering i rotte

Summary

Vi etablere en kirurgiske teknikken for en i vivo enkelt leveren lobe perfusjon-modell i rotte som en forutsetning for å ytterligere studere i vivo delvis leveren engineering i fremtiden.

Abstract

Orgel engineering er en ny strategi å generere leveren orgel erstatter som potensielt kan brukes i transplantasjon. Nylig i vivo leveren engineering, inkludert i vivo organ decellularization etterfulgt av repopulation har dukket opp som en lovende tilnærming over ex vivo leveren engineering. Postoperative overlevelse var imidlertid ikke oppnådd. Målet med denne studien er å utvikle romanen kirurgisk teknikk i vivo selektiv leveren lobe perfusjon i rotter som en forutsetning for i vivo leveren engineering. Vi generere en krets bypass bare gjennom den venstre lateral lobe. Deretter er det venstre lateral lobe parfyme med heparinized saltvann. Eksperimentet utføres med 4 grupper (n = 3 rotter per gruppe) basert på ulike perfusjon ganger 20 min, 2 h, 3t og 4 h. overlevelse, samt macroscopically synlig endring av farge og histologisk bestemt fravær av blodceller i den portalen triad og sinusoids, tas som en indikator for et vellykket modell etablissement. Etter selektiv perfusjon av den venstre lateral lobe ser vi at den venstre lateral lobe, faktisk slått fra rød til svak gul. En histologiske vurdering, ingen blod celler vises i grenen av portalen blodåre, sentrale venen og sinusoids. Venstre lateral lobe rødt etter gjenåpningen blokkerte fartøyene. 12/12 rotter overlevde prosedyren for mer enn en uke. Vi er først til å rapportere en kirurgisk modell for i vivo enkelt leveren lobe perfusjon med en lang overlevelse på mer enn én uke. I motsetning til tidligere publiserte rapporten, viktigste fordelen av teknikken presenteres her er perfusjon av 70% av leveren er bevart gjennom hele prosedyren. Opprettelsen av denne teknikken gir et fundament i vivo delvis leveren Engineering i rotter, inkludert decellularization og recellularization.

Introduction

Indikasjoner for organtransplantasjon utvide stadig. I kontrast, faller orgel donasjon priser og kvaliteten organer, fører til en økende etterspørsel etter grafts. Antall kandidater til ventelisten levertransplantasjon fortsatte å øke (f.eksi USA, 11,340 pasienter ble lagt i 2016, sammenlignet med 10,636 i 2015)¹. Til tross for betydelig innsats oppfyller antall tilgjengelige organer ikke kliniske behov. På grunn av den økte forekomsten av leversykdom, mange pasienter med sluttstadiet leversykdommer dø på venteliste før en donor organ transplantasjon blir tilgjengelig. For å møte den enorme etterspørselen etter giver leveren grafts, forfulgt alternative tilnærminger bruker leveren vev engineering prinsipper blir aktivt². I dag, kunne en nyutviklet biologiske teknikk av leveren engineering potensielt overvinne denne mangel.

Leveren engineering består av to trinn: generering av en acellular skafottet, etterfulgt av en repopulation i stillaset. For å få et biologisk acellular leveren stillas, er explanted leveren perfused via vaskulære system med ionic eller ikke-ionisert vaskemidler, som kan fjerne cellulære materialet fra leveren. I de fleste tidligere studier, ble en biologisk acellular leveren stillaset oppnådd av perfusjon av leveren med en kombinasjon av natrium dodecyl sulfate og TritonX100. Som et resultat ble alle celler fjernet, mens strukturen til den ekstracellulære matrisen ble opprettholdt. Orgel stillasene var reseeded med eldre celler, hepatocellulært, samt endothelial cellelinjer og primære hepatocytter med eller uten samtidig bruk av endotelceller eller mesenchymal stamceller (MSC). De fleste forskere fokus på ex vivo leveren engineering^{3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14}. Men i de fleste tidligere studier, ble bare små biter av nytt stillaset kuber transplantert inn i forskjellige heterotopic implantasjon nettsteder. I et par studier, ble delvis nytt stillaser transplantert som en ekstra pode. Maksimal rapporterte overlevelse tidspunktet var imidlertid bare 72 h^8,14. Så vidt vi vet, har ennå ikke orthotopic transplantasjon av en repopulated full leveren pode er utført eller publisert om. Langsiktig funksjonen og transplantasjon utvikling organer er fortsatt i sin barndom. Derfor er en alternativ tilnærming til ex vivo leveren engineering nødvendig.

I vivo leveren ingeniørvitenskap kan representere et alternativ å studere hepatic repopulation under fysiologiske forhold. Fordelene i vivo leveren engineering sammenlignet ex vivo leveren engineering er mange. I vivo nytt delvis leveren stillaset er utsatt for fysiologiske blodperfusjon med riktig temperatur, tilstrekkelig oksygen, næringsstoffer og vekstfaktorer i motsetning til ex vivo perfusjon med kunstig kultur medium. Videre opprettholder gjenværende delvis normal leveren funksjonen hepatic, hovedsakelig slik at langsiktig overlevelse. Siden en implantert ex vivo konstruert leveren pode er fortsatt i stand til å opprettholde den langsiktige overlevelsen av forsøksdyr av sin leveren funksjon⁸, vi ser at i vivo delvis lever engineeringwould til slutt bli en lovende modell å lære om utviklingen av konstruert lever med lengre overlevelse observasjoner enn ex vivo.

Nylig presentert en forskergruppe (Pan og kolleger), for første gang, teknikk i vivo leveren engineering¹⁵. De oppnådde den isolerte perfusjonen av den høyre dårligere leveren flik i levende rotter tross anatomiske og tekniske utfordringer. De rapporterte første intraoperativ resultatene i vivo repopulation bruker en rotte primære hepatocyte cellen linje. Imidlertid kirurgisk perfusjon i vivo modell av Pan et al. har ulemper. De oppnådde enkelt leveren lobe perfusjon i rotter på bekostning av fullstendig blokkere portalen blodåre og mindreverdig vena cava, som kan forårsake alvorlig skade på dyret. Eksperimentell rottene ble ofret etter bare 6 timer intraoperativ observasjon. Derfor trenger i vivo leveren lobe perfusjon teknikken ytterligere forbedring å oppnå postoperativ overlevelse.

Vi utviklet en roman overlevelse modell for i vivo leveren lobe perfusjon, basert på tidligere studier av hepatic anatomi av rotte¹⁶, portalen blodåre cannulation teknikken for hemodynamic overvåking i mus¹⁷, og lever bioteknologi ^{18 , 19}. de viktigste trinnene fremgangsmåten er illustrert i figur 1A – 1E.

Denne teknikken er egnet for de som vil bruke dette eksperimentelle i vivo perfusjonsmåler modell for grunnleggende forskning på delvis orgel behandling av infusjon med narkotika, i vivo decellularization som en kjemisk resection for orgel sykdommer (f.eks , leverkreft), i vivo cellekultur i en decellularized matrise sammenligne ex vivo todimensjonal og tredimensjonale celle kultur, systemer,^20,,^21,,^22,,^{23 , 24 , 25 , 26}og i vivo leveren engineering ved decellularization og repopulation.

Protocol

Boliger og alle prosedyrer utført var i samsvar med tysk dyrs rettigheter lovgivning. Alle gasbind, dekker klær og Kirurgiske instrumenter er autoklaveres og forberedt før operasjonen. Alle prosedyrer blir utført under sterile forhold. 1. forberedelse av rotte til den kirurgiske prosedyren Plasser rotta i en induksjon kammer og bedøve rotte med 4% fordampede isoflurane og 100% oksygen på 0,5 L/min i ca 3 min, til rotta er helt anesthetized. Ta rotta ut av induksjon ka…

Representative Results

Tolv mann (alderen 12 – 13 uker) Lewis rotter ble brukt til å vurdere effekten av selektiv leveren lobe perfusjon. Eksperimentet ble gjennomført i fire grupper (n = 3 rotter per gruppe). Bruker ulike perfusjon perioder med 20 minutter, oppnådd 2 timer, 3 timer og timer, følge fremgangsmåten beskrevet ovenfor, vi i vivo enkelt lobe perfusjon. I Vivo Perfusjon av den venstre…

Discussion

Ved å blokkere og cannulating venstre portalen blodåre med et kateter som en flytende vik og venstre lateral hepatic venen med en annen kateter som en flytende utløp, generert vi har en i vivo væske omkjøringsvei i den venstre lateral lobe, indikerer at men teknikken er svært utfordrende den lille størrelsen på skipene i cannulation og en høy risiko for forårsaker blødninger, er det mulig. Selv rotter gjennomgår en lang Perfusjonsperiode 4 timer overlevd minst 1 uke, viser at rottene kunne tolerere d…

Materials

Perfusion Pump
Perfusor VI	B. Braun, Melsungen
Catheter
Versatus-W  Catheter	Terumo	SR+DU2419PX	24G, 0.74×19mm
Versatus-W  Catheter	Terumo	SR+DU2225PX	22G, 0.9×25mm
micro surgical instrument
micro scissors	F·S·L	No. 14058-09
micro serrefine	F·S·L	No.18055-05
Micro clamps applicator	F·S·L	No. 18057-14
Straight micro forceps	F·S·L	No. 00632-11
Curved micro forceps	F·S·L	No. 00649-11
micro needle-holder	F·S·L	No. 12061-01
general surgical instruments
standard sissors	F·S·L
mosquito clamp	F·S·L
serrated forcep	F·S·L
teethed forcep	F·S·L
needle-holder	F·S·L
suture
4-0 prolene	ethicon
4-0 ETHICON*II	ethicon
6-0 silk	ethicon
11-0 polyamide	ethicon