Una novedosa técnica quirúrgica como base para In Vivo parcial ingeniería hígado de rata
Summary
Establecemos una novedosa técnica quirúrgica para un modelo de perfusión en vivo solo lóbulo hepático de rata como requisito previo para el estudio adicional en vivo hígado parcial en el futuro de la ingeniería.
Abstract
Ingeniería de órganos es una nueva estrategia para generar sustitutos de hígado órgano que potencialmente pueden ser utilizados en el trasplante. Recientemente, en vivo hígado ingeniería, incluyendo en vivo órgano descelularización seguido de repoblación, ha surgido como un enfoque prometedor sobre ingeniería ex de vivo hígado. Sin embargo, no se logró la supervivencia postoperatoria. El objetivo de este estudio es desarrollar una nueva técnica quirúrgica en vivo perfusión selectiva del lóbulo hepático en las ratas como requisito previo para la ingeniería en vivo hígado. Generamos un circuito bypass sólo a través del lóbulo lateral izquierdo. Entonces, el lóbulo lateral izquierdo es inundado con solución salina heparinizada. El experimento se realizó con 4 grupos (n = 3 ratas por grupo) basado en tiempos diferentes de la perfusión de 20 min, 2 h, 3 h y 4 h. supervivencia, así como el cambio macroscópico visible del color y la ausencia histológico determinada de células de la sangre en el tríada portal y los sinusoides, es tomado como un indicador para el establecimiento de un modelo de éxito. Después de la perfusión selectiva del lóbulo lateral izquierdo, observamos que el lóbulo lateral izquierdo, de hecho, dio vuelta de rojo a amarillo débil. En una evaluación histológica, células de la sangre no son visibles en la rama de la vena porta, la vena central y los sinusoides. El lóbulo lateral izquierdo cambia a rojo después de la reapertura de los vasos obstruidos. 12/12 ratas sobrevivieron el procedimiento más de una semana. Somos el primer para divulgar un modelo quirúrgico para la perfusión sola lóbulo hepático en vivo con un período de supervivencia larga de más de una semana. En contraste con el informe previamente publicado, la ventaja más importante de la técnica presentada aquí es que la perfusión del 70% del hígado se mantiene a lo largo de todo el procedimiento. El establecimiento de esta técnica proporciona una base para en vivo parcial ingeniería hepática en ratas, como descelularización y recelularización.
Introduction
Las indicaciones para el trasplante de órganos están ampliando constantemente. Por el contrario, están disminuyendo las tasas de donación de órganos y la calidad general de los órganos, llevando a una creciente demanda de injertos. Continuó aumentando el número de candidatos ha añadido a la lista de espera de trasplante de hígado (p. ej., en los Estados Unidos, 11.340 pacientes fueron agregados en el año 2016, en comparación con 10.636 en 2015)1. A pesar de considerables esfuerzos, el número de órganos disponibles necesidades clínicas. Debido a la incidencia creciente de enfermedad hepática, muchos pacientes con enfermedades hepáticas de fase final muere en lista de espera de trasplante ante un órgano de donante disponible. Para satisfacer la enorme demanda de injertos de donantes, alternativas, utilizando tejido del hígado principios de ingeniería están siendo activamente persiguen2. Hoy en día, una técnica biológica desarrollada recientemente de ingeniería hepática potencialmente podría superar esta escasez.
Ingeniería hígado consta de dos pasos: la generación de un andamio acelular, seguido de una repoblación del andamio. Para obtener un andamio biológico de hígado acelular, el hígado explanted es inundada por el sistema vascular con detergentes iónicos o no iónicos, que se puede quitar el material celular del hígado. En la mayoría de los estudios anterior, un andamio biológico de hígado acelular fue alcanzado por la perfusión del hígado con una combinación de dodecil sulfato de sodio y TritonX100. Como resultado, todas las células fueron quitadas, mientras que se mantuvo la estructura de la matriz extracelular. Las matrices de soporte de órgano fueron resembrados con células maduras, hepatocelular, así como líneas de células endoteliales y hepatocitos primarios con o sin la aplicación simultánea de las células endoteliales o células madre mesenquimales (MSC). Enfoque de los investigadores más en vivo ex hígado ingeniería3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Sin embargo, en la mayoría de los estudios anterior, sólo pequeños trozos de cubos repoblado andamio fueron transplantadas en sitios diferentes de implantación heterotópica. En algunos estudios, andamios repoblación parciales fueron trasplantados como injertos auxiliares. Sin embargo, la máxima supervivencia divulgada fue sólo 72 h8,14. Lo que sabemos, trasplante ortotópico de un injerto completo higado repoblado aún no ha sido realizado o publicado sobre. La función a largo plazo y trasplante de órganos modificados son todavía en su infancia. Por lo tanto, es necesario un enfoque alternativo a la ex vivo hígado ingeniería.
En vivo hígado ingeniería puede representar una alternativa para el estudio hepático repoblación bajo condiciones fisiológicas. Las ventajas de en vivo hígado ingeniería comparado con ingeniería ex de vivo hepática son múltiples. En vivo repoblado parcial hígado andamio está sometido a perfusión sanguínea fisiológica con la temperatura adecuada, suficiente oxígeno, nutrientes y factores de crecimiento en contraste con perfusión ex vivo con medio de cultivo artificial. Además, el hígado normal parcial restante mantiene la función hepática, principalmente, lo que permite la supervivencia a largo plazo. Puesto que un injerto de hígado implantado ex vivo diseñado es todavía incapaz de sostener la supervivencia a largo plazo de animales de experimentación por su función hepática8, imaginamos que en vivo parcial hígado engineeringwould en última instancia convertirse en un modelo prometedor para estudiar más la evolución de la ingeniería hígados con más observaciones de supervivencia de ex vivo.
Recientemente, un grupo de investigación (Pan y colegas) presentó, por primera vez, una técnica de en vivo hígado ingeniería15. Alcanzaron la perfusión aislada del lóbulo inferior derecho hígado en ratas vivas a pesar de los desafíos técnicos y anatómicos. Ellos reportaron los primeros resultados intraoperativos de en vivo repoblación mediante una línea de celular de hepatocitos primarios de rata. Sin embargo, el modelo de perfusión quirúrgica en vivo de Pan et al. tiene desventajas. Alcanzaron la perfusión sola lóbulo hepático en ratas a costa de bloquear totalmente la vena porta y vena cava inferior, que puede causar grave daño al animal. Las ratas experimentales fueron sacrificadas después de sólo 6 horas de tiempo de observación intraoperatoria. Por lo tanto, la técnica de perfusión en vivo lóbulo hepático necesita mejora para lograr la supervivencia postoperatoria.
Desarrollamos un modelo de supervivencia nuevo para en vivo lóbulo hepático de la perfusión, basado en estudios previos de la Anatomía hepática de rata16, la técnica de canulación de la vena porta para monitoreo hemodinámico en ratones17y Bioingeniería hígado 18 , 19. los pasos claves para el procedimiento se ilustración en la figura 1A – 1E.
Esta técnica es adecuada para aquellos que quieran utilizar este modelo de perfusión experimental en vivo para la investigación básica en el tratamiento de órgano parcial por infusión de drogas, descelularización en vivo como una resección química para las enfermedades de órgano (p. ej. , cáncer de hígado), en vivo el cultivo de células en una matriz decellularized comparar ex vivo bidimensional y tridimensional de la célula cultura sistemas20,21,22,23 , 24 , 25 , 26y en vivo hígado ingeniería descelularización y repoblación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bloqueando y canular la vena porta izquierda con un catéter como una entrada de fluido y la vena hepática izquierda lateral con otro catéter como un fluido, con éxito generamos un puente fluido en vivo dentro del lóbulo lateral izquierdo, lo que indica que Aunque la técnica es muy difícil debido al tamaño pequeño de los vasos para la canulación y a un alto riesgo de causar hemorragias, es factible. Incluso las ratas en período de perfusión larga de 4 horas sobrevivieron por lo menos 1 semana, mostran…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean dar las gracias Jens Geiling desde el Instituto de Anatomía I, Hospital de la Universidad de Jena, para producir los dibujos esquemáticos de la anatomía del hígado de rata.
Materials
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon | ||
Riferimenti
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