En ny kirurgisk teknik som en grund för In Vivo delvis lever Engineering i råtta
Summary
Vi etablera en ny kirurgisk teknik för en genomblödning i vivo enda lever LOB modell råtta som en förutsättning för att ytterligare studera i vivo partiell levern engineering i framtiden.
Abstract
Orgel engineering är en ny strategi för att generera levern orgel substitut som potentiellt kan användas vid transplantation. Nyligen, i vivo lever ingenjörsvetenskap, inklusive in-vivo orgel decellularization följt av återinsättning, har vuxit fram som en lovande strategi över ex vivo lever engineering. Däremot uppnåddes inte postoperativ överlevnad. Syftet med denna studie är att utveckla en ny kirurgisk teknik av i vivo selektiv lever LOB perfusion hos råttor som en förutsättning för i vivo lever engineering. Vi genererar en krets bypass endast genom den vänstra laterala loben. Sedan, är den vänstra laterala loben perfusion med hepariniserad saltlösning. Experimentet utförs med 4 grupper (n = 3 råttor per grupp) baserat på olika perfusion gånger 20 min, 2 h, 3 h och 4 h. överlevnad, liksom den makroskopiskt synliga förändringen av färg och histologiskt beslutsamma avsaknad av blodkroppar i den portalen triad och sinusoider, tas som en indikator för en framgångsrik modell etablering. Efter selektiv perfusionen i den vänstra laterala loben observerar vi att den vänstra laterala loben, faktiskt vände från röda till svagt gul. En histologisk utvärdering syns inga blodkroppar inom grenen av portalen ven, central ven och sinusoider. Den vänstra laterala loben röd efter nyöppningen de blockerade fartyg. 12/12 råttor överlevde förfarandet för mer än en vecka. Vi är först att rapportera en kirurgisk modell för i vivo enda lever LOB perfusion med en lång överlevnad period av mer än en vecka. I motsats till den tidigare publicerade rapporten, den viktigaste fördelen med tekniken presenteras här är att perfusionen i 70% av levern upprätthålls under hela förfarandet. Inrättandet av denna teknik ger en grund för i vivo delvis lever engineering hos råttor, inklusive decellularization och recellularization.
Introduction
Indikationerna för organtransplantation är ständigt växande. Däremot minskar organ donation priser och kvaliteten hos organ, vilket leder till en ökad efterfrågan på transplantat. Antalet kandidater till levertransplantation väntelistan fortsatte att öka (t.ex., i USA, 11,340 patienter lades under 2016, jämfört med 10,636 2015)1. Trots stora ansträngningar uppfyller antalet tillgängliga organ inte kliniska behov. På grund av den ökade förekomsten av leversjukdom, många patienter med slutstadiet leversjukdomar die på väntelistan innan en givare organ transplantation blir tillgänglig. För att möta den stora efterfrågan på givare levern ympkvistar, eftersträvas alternativa metoder med hjälp av levervävnad tekniska principer att aktivt2. Nuförtiden, kunde en nyutvecklad biologiska teknik lever högskola potentiellt övervinna denna brist.
Lever engineering består av två steg: generering av ett acellulärt schavotten, följt av en återinsättning av ställningen. För att erhålla en biologisk acellulärt lever byggnadsställning, är explanterad levern perfunderade via kärlsystemet med jonisk eller Nonjonaktivt rengöringsmedel, som kan ta bort det cellulära materialet från levern. I de flesta tidigare studier uppnåddes en biologisk acellulärt lever byggnadsställning av perfusionen i levern med en kombination av sodium dodecyl sulfate och TritonX100. Som ett resultat, togs alla celler bort, medan strukturen i den extracellulära matrixen bibehölls. De orgel ställningar var sådd med mogna celler, hepatocellulär, samt endothelial cellinjer och primära hepatocyter med eller utan samtidig tillämpning av endotelceller eller mesenkymala stamceller (MSC). De flesta forskare fokus på ex vivo lever engineering3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. I de flesta tidigare studier transplanterade dock bara små bitar av nyinsatta byggnadsställning kuber i olika heterotopisk implantationsställen. I några studier transplanterades partiell nyinsatta ställningar som extra transplantat. Maximal rapporterade överlevnadstiden var dock endast 72 h8,14. Såvitt vi vet, har ortotop transplantation av en nyinsatta full lever transplantat ännu inte utfört eller publicerats om. Den långsiktiga funktion och konstruerade organtransplantation är fortfarande i sin linda. Därför behövs en alternativ strategi för ex vivo lever engineering.
In vivo lever engineering kan utgöra ett alternativ till att studera nedsatt återinsättning under fysiologiska betingelser. Fördelarna med i vivo lever engineering jämfört med ex vivo lever engineering är mångfaldiga. I vivo nyinsatta delvis lever schavotten betvingas till fysiologiska blodgenomströmning med rätt temperatur, tillräcklig syre, näringsämnen och tillväxtfaktorer i motsats till ex vivo perfusion med artificiellt odlingsmedium. Dessutom upprätthåller återstående delvis normala levern nedsatt funktion, att främst tillåta långsiktiga överlevnad. Eftersom en inopererad ex vivo konstruerad lever transplantat är fortfarande oförmögen att upprätthålla långsiktiga överlevnad försöksdjur av dess leverfunktionen8, föreställer vi att in-vivo delvis lever engineeringwould i slutändan bli en lovande modell för att ytterligare studera utvecklingen av bakåtkompilerade lever med längre överlevnad iakttagelser än ex vivo.
Nyligen presenterade en forskargrupp (panorera och kollegor), för första gången, en teknik i vivo levern engineering15. De uppnått den isolerad perfusionen av just sämre lever LOB på levande råttor trots anatomiska och tekniska utmaningar. De rapporterade första intraoperativ resultaten av i vivo återinsättning använder en råtta primära hepatocyte cellinje. Dock i vivo kirurgiska perfusion modell Pan et al. har nackdelar. De uppnått enda lever LOB perfusion hos råttor på bekostnad av helt blockerar den portalen ven och sämre vena cava, vilket kan orsaka allvarlig skada för djuret. Experimentell råttorna offrades efter bara 6 timmar av intraoperativ observationstid. Därför behöver i vivo lever LOB perfusion tekniken förbättras att uppnå postoperativ överlevnad.
Vi utvecklat en roman överlevnad modell för i vivo lever LOB perfusion, baserat på tidigare studier av råtta16, portalen ven kanylering tekniken för hemodynamisk övervakning i möss17och levern bioengineering nedsatt anatomi 18 , 19. de viktigaste stegen för förfarandet illustreras i figur 1A – 1E.
Denna teknik är lämplig för dem som vill använda denna experimentella i vivo perfusion modell för grundforskning om partiell orgel behandling av infusion med droger, i vivo decellularization som en kemisk resektion för orgel sjukdomar (t.ex. , levercancer), in-vivo cellkultur i en cell-lösa matris jämföra ex vivo tvådimensionell och tredimensionell cell kultur system20,21,22,23 , 24 , 25 , 26och i vivo lever engineering av decellularization och återinsättning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genom att blockera och cannulating vänstra portalen ven med en kateter som en flytande inlopp och den vänstra laterala nedsatt ven med en annan kateter som en flytande utlopp, genererade framgångsrikt vi en in-vivo vätska bypass inom den vänstra laterala loben, som anger att även om tekniken är mycket utmanande på grund av den lilla storleken på fartygen för kanylering och en hög risk för orsakar blödning, är det möjligt. Även de råttor som genomgår en lång perfusion 4 timmar överlevde minst …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Jens Geiling från Institutet av anatomin I, Jena universitetssjukhus, för att producera de schematiska ritningarna av råtta lever anatomi.
Materials
| Perfusion Pump | |||
| Perfusor VI | B. Braun, Melsungen | ||
| Catheter | |||
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2419PX | 24G, 0.74×19mm |
| Versatus-W Catheter | Terumo | SR+DU2225PX | 22G, 0.9×25mm |
| micro surgical instrument | |||
| micro scissors | F·S·L | No. 14058-09 | |
| micro serrefine | F·S·L | No.18055-05 | |
| Micro clamps applicator | F·S·L | No. 18057-14 | |
| Straight micro forceps | F·S·L | No. 00632-11 | |
| Curved micro forceps | F·S·L | No. 00649-11 | |
| micro needle-holder | F·S·L | No. 12061-01 | |
| general surgical instruments | |||
| standard sissors | F·S·L | ||
| mosquito clamp | F·S·L | ||
| serrated forcep | F·S·L | ||
| teethed forcep | F·S·L | ||
| needle-holder | F·S·L | ||
| suture | |||
| 4-0 prolene | ethicon | ||
| 4-0 ETHICON*II | ethicon | ||
| 6-0 silk | ethicon | ||
| 11-0 polyamide | ethicon | ||
Riferimenti
- Kim, W. R., et al. OPTN / SRTR 2016 Annula Data Report: Liver. American Journal of Transplantation. Suppl. 1, 172-253 (2018).
- Palakkan, A. A., Hay, D. C., Anil Kumar, P. R., Kumary, T. V., Ross, J. A. Liver tissue engineering and cell sources: issues and challenges. Liver International. 33, 666-676 (2013).
- Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326, 1216-1219 (2009).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nature Methods. 2, 119-125 (2005).
- Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47, 1394-1400 (2008).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33, 448-458 (2013).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Jiang, W. C., et al. Cryo-chemical decellularization of the whole liver for mesenchymal stem cells-based functional hepatic tissue engineering. Biomaterials. 35, 3607-3617 (2014).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).
- Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53, 604-617 (2011).
- Bruinsma, B. G., Kim, Y., Berendsen, T. A., Yarmush, M. L., Uygun, B. E. Layer-by-layer heparinization of decellularized liver matrices to reduce thrombogenicity of tissue engineered grafts. Journal of Clinical and Translational Research. 1 (1), (2015).
- Park, K. M., et al. Decellularized Liver Extracellular Matrix as Promising Tools for Transplantable Bioengineered Liver Promotes Hepatic Lineage Commitments of Induced Pluripotent Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 22, 449-460 (2014).
- Ko, I. K., et al. Bioengineered transplantable porcine livers with re-endothelialized vasculature. Biomaterials. 40, 72-79 (2015).
- Bao, J., et al. Construction of a portal implantable functional tissue-engineered liver using perfusion-decellularized matrix and hepatocytes in rats. Cell Transplantation. 20, 753-766 (2011).
- Pan, J., et al. In-vivo organ engineering: Perfusion of hepatocytes in a single liver lobe scaffold of living rats. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 80, 124-131 (2016).
- Madrahimov, N., et al. Marginal hepatectomy in the rat: from anatomy to surgery. Annals of Surgery. 244, 89-98 (2006).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs. European Surgical Research. 57, 224-239 (2016).
- Mussbach, F., Settmacher, U., Dirsch, O., Dahmen, U. Liver engineering as a new source of donor organs: A systematic review. Der Chirurg. 87, 504-513 (2016).
- Xie, C., et al. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51955 (2014).
- Zhou, P., et al. Decellularization and Recellularization of Rat Livers With Hepatocytes and Endothelial Progenitor Cells. Artificial Organs. 40, E25-E38 (2016).
- Yagi, H., et al. Human-scale whole-organ bioengineering for liver transplantation: a regenerative medicine approach. Cell Transplantation. 22, 231-242 (2013).
- Otsuka, H., Sasaki, K., Okimura, S., Nagamura, M., Nakasone, Y. Micropatterned co-culture of hepatocyte spheroids layered on non-parenchymal cells to understand heterotypic cellular interactions. Science and Technology of Advanced Materials. 14, 065003 (2013).
- Bale, S. S., et al. Long-term coculture strategies for primary hepatocytes and liver sinusoidal endothelial cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 21, 413-422 (2015).
- Wu, Q., et al. Optimizing perfusion-decellularization methods of porcine livers for clinical-scale whole-organ bioengineering. BioMed Research International. , 785474 (2015).
- Barakat, O., et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of Surgical Research. 173 (1), e11-e25 (2012).
- Navarro-Tableros, V., et al. Recellularization of rat liver scaffolds by human liver stem cells. Tissue Engineering Part A. 21 (11-12), 1929-1939 (2015).
