Denne protokollen beskriver en semi-automatisert tilnærming for å produsere hepatocyte-lignende celler fra menneskelige pluripotent stamceller i 96 godt plate format. Denne prosessen er rask og kostnadseffektiv, slik at produksjonen av kvalitet forsikret grupper av hepatocyte-lignende celler for grunnleggende anvendt menneskelige forskning.
Menneskelige pluripotent stamceller representerer en fornybar menneskelig vev. Vår forskning er fokusert på å generere menneskelige leveren vev fra menneskelige embryonale stamceller (hESCs) og indusert pluripotent stamceller (iPSCs). Gjeldende differensiering prosedyrer generere menneskelige hepatocyte-lignende celler (HLCs) viser en blanding av fetal og voksen egenskaper. For å forbedre celle fenotype, har vi fullt definert vår differensiering prosedyre og celle nisje, som resulterer i generasjonen av celle populasjoner som viser forbedret genuttrykk og funksjon. Mens disse studiene merke fremgang, har muligheten til å generere store mengder multi bra plater for screening vært begrenset av arbeidskraft intensiv prosedyrer og parti til parti variasjon. For å takle dette problemet, har vi utviklet en halvautomatisk plattform for å skille pluripotent stamceller i HLCs. stilk cellen såing og differensiering ble utført med flytende håndtering og automatiske pipettering systemer i 96-brønnen plate format. Etter differensiering, celle fenotypen ble analysert ved hjelp av automatiserte mikroskopi og en multi godt luminometer.
Primære menneskelige hepatocytter (PHHs) representerer den gjeldende standarden for leveren biomedisinsk forskning. Til tross for sine fordeler er PHHs en begrenset kilde modne hepatocytes med ustabil fenotypen1. Menneskelige embryonale stamceller (ESCs) og menneskelige indusert pluripotent stamceller (iPSC) har blitt foreslått som en sterk ressurs for biomedisinsk forskning, lovende en fornybar menneskelig vev, inkludert leveren2,3,4 . Gjeldende hepatocyte differensiering prosedyrer generere celler som uttrykker hepatocyte markører og gener funksjoner som ligner på PHHs3,4,5,6,7, 8,9,10,11. Flere nylig, bruk av definerte materialer og matriser som rekombinant laminins, har forbedret celle fenotypen og eksperimentelle reproduserbarhet5,12,13,14.
Tradisjonelle celle kultur teknikker stole tungt på manuell pipettering, som er både tidkrevende og feil. Dette begrenser gjennomstrømningen av analysen og plate formatet ettall kanne operere med. Hittil er de fleste studier som beskriver generering av HLCs arbeidsintensiv i naturen og derfor liten skala i størrelse15,16,17.
Gjeldende fremskritt innen flytende håndtering og pipettering systemer, i kombinasjon med automatisert mikroskopi og laboratoriet Analysatorer, har gjort det mulig å utvikle prosedyrer som minimerer behovet for menneskelig inngripen. Vi har tatt nytte av disse teknologiene og utviklet et semi-automatisert differensiering å generere store mengder av menneskelig leveren vev Basic og brukt biomedisinsk forskning. Denne tilnærmingen kan utføres med både menneskelige ESC og iPSC linjer med mindre justeringer nødvendig, avhengig av den cellen linjen. Kombinerer dette systemet med høy innhold analyse, viser vi at HLC phenotyping kan være mindre tidkrevende og utført på skala18,19,20,21.
I sammendraget, har automatisering av celle kultur teknikker beskrevet her ført til forbedringer i pålitelighet, eksperimentelle tidsstyring og analysen gjennomstrømming.
Våre halvautomatisk prosedyren er effektiv, pålitelig og økonomisk, slik at produksjonen av HLCs på skalaen (figur 1). Det var ikke noen signifikant forskjell i antall celler mellom brønnene på plate, gjør denne plattformen en passende tilnærming til cellen-basert screening (figur 2). I tillegg gjør semi automatisering arbeidsflyten det mulig å produsere store antall plater samtidig, som ikke var mulig før du bruker manuelle prosesser5,12.
Viktigere, automatiseringen prosessen bydde ikke innvirkningen på differensiering avkastning, med fleste celler uttrykke HNF4α (89,2% ± 2) og ALB (92.8% ±6) (Figur 3). HLCs også uttrykt CYP P450 enzymer CYP2D6 og CYP3A4 og vises CYP1A2 og CYP3A metabolsk aktivitet sammenlignes med tidligere rapporterte eksperimenter (Figur 3)5. Til tross for standardisering av protokollen er celle confluency før differensieringen avgjørende for ren HLC differensiering. Derfor en god celle distribusjon over brønnen er en viktig faktor (figur 1). Dette har vist seg for å være cellen linje avhengig, derfor celle såing og tetthet optimalisering kreves for hver celle linje før å skalere opp.
I sin nåværende form, denne plattformen passer ikke å produsere store mengder HLCs for klinisk bruk, og dette vil sannsynligvis oppnås gjennom bruk av cellen fabrikker og bioreactors. Imidlertid tillater metodikk utviklet rask generering av menneskelig leverceller for sykdom modellering, narkotikarelaterte screening og/eller narkotika gjenbruk studier. Videre er analysen mottakelig for multiplexing, tillater generering av multiparametric datasett for mekanistisk analyse. Fremover, tror vi også at denne teknologien kan brukes til mer komplekse i vitro systemer som 3D differensiering eller som en plattform for å forbedre HLC fenotypen i vitro.
Avslutningsvis tror vi at vårt enkle og semi-automatisert system vil øke eksperimentelle gjennomstrømning, og redusere eksperimentelle variasjon, og dermed forbedre kvaliteten på biologiske datasett og deres ekstrapolering mot menneskelige fysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med priser fra den vitenskapsmann Office (TCS/16/37) og en MRC PhD stipend.
405 LS Washer | Biotek | ||
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
GripTips for VIAFLO 96 | Integra | 6434 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermoFisher | 5840300 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Standard tube dispensing cassette | ThermoFisher | 24072670 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette | Integra | 6001 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1.00496 EMD MILLIPORE | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Abcam | ab3980 | 1:500 (mouse) |
CYP2D6 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Anti-Mouse 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11001 | 1:400 |
Anti-sheep 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11015 | 1:400 |
Anti-rabbit 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11008 | 1:400 |