Målet med denna artikel är att presentera en metod som möjliggör en 3-dimensionell rekonstruktion av cerebrovaskulära trädet hos möss efter mikro beräknat tomografi och bestämning av volymer av hela fartygssegment som kan användas för att kvantifiera cerebral vasospasm i murina modeller av subarachnoidalblödning.
Subarachnoidalblödning (SAH) är en undertyp av hemorragisk stroke. Cerebral vasospasm som uppstår i efterdyningarna av blödningen är en viktig faktor att avgöra patientens resultatet och därför tas ofta som en slutpunkt för studien. Dock i liten djurstudier på SAH är kvantifieringen av cerebral vasospasm en stor utmaning. Här presenteras en ex vivo -metod som tillåter kvantifiering av volymer av hela fartygssegment, som kan användas som ett objektivt mått för att kvantifiera cerebral vasospasm. I ett första steg utförs endovaskulär gjutning av de cerebrala kärl med en röntgentät gjutning agent. Sedan, imaging tvärsnittsdata förvärvas av micro datortomografi. Det sista steget innebär 3-dimensionell rekonstruktion av virtuella vaskulär trädet, följt av en algoritm för att beräkna center linjer och volymer av de valda fartygssegment. Metoden gav en mycket noggrann virtuell rekonstruktion av cerebrovaskulära trädet visas genom en diameter-baserade jämförelse av anatomiska prover med sin virtuella rekonstruktioner. Fartyg volymerna jämfört med fartyget diametrar ensam, och belysa skillnader mellan vasospastisk och icke-vasospastisk fartyg visas i en serie av SAH och sham manövrerade möss.
Aneurysmatic subarachnoidalblödning (SAH), en undertyp av hemorragisk stroke, är en vanlig sjukdom i neurointensivvård intensivvårdsavdelningar. Förutom tidig hjärnskada (EBI), som består av cerebral skada orsakad av blödning händelsen i sig, en annan viktig faktor att avgöra patientens resultatet är fördröjd cerebral ischemi (DCI), definieras av klinisk försämring genom nedsatt cerebral perfusion eller cerebral infarkt inte associerade med interventionella eller kirurgiska förfaranden1,2,3. Viktiga mekanismer bidrar till DCI är vasospasms av stora cerebrala kärl dels; Däremot, mikrocirkulatoriska dysfunktion med vasospasm av microvesselsna och microthrombosis och ischemi besläktade kortikala fördelande fördjupningar med en roll (ses i Madonald 20141). Därför, diagnos av vasospasm i de stora cerebrala kärl är avgörande i klinisk praxis och visar en viktig slutpunkt i många kliniska och experimentella studier.
Trots att funktionerna i vasospasm i murina SAH modeller inte är direkt överförbar till mänskliga patienten, murina modeller av SAH relaterade vasospasm har varit av växande betydelse under de senaste åren. I dessa modeller framkallas SAH av endovaskulära glödtråden perforering4,5,6,7,8, transection av cisternal fartyg9eller injektion av blod i GSR10 ,11,12. I motsats till stora djurmodeller av SAH som var traditionellt utformade att studera vasospasm13, har murina modeller den stora fördelen att det finns många transgena möss stammar. Detta gör dem ett utmärkt verktyg för att studera molekylära mekanismer leder till vasospasm och DCI. Bestämning av cerebral vasospasm hos möss är dock utmanande. Detta beror på att i motsats till stora djurmodeller där vasospasm kan undersökas med hjälp av kliniska avbildningstekniker, i vivo imaging för att analysera cerebral vasospasm hos möss inte är ännu tillgängliga. Därför bestäms vanligen vasospasm använder antingen histologiska sektioner10,11 eller mikroskopiskt efter gjutning av cerebrala kärl7,9,12. Dessa tekniker har dock nackdelen att fartyget diametrar undersöks vid definierade punkter endast.
Detta manuskript baserat på en tidigare studie7, och presenterar en metod för mål och reproducerbara analys av vasospasm i en murin SAH-modell. Metoden är baserat på perfusion och gjutning av cerebrala kärl, ex vivo mikro-datortomografi, digital rekonstruktion av fartyget trädet, och efterföljande utvärdering av volymer av hela cerebrala kärl.
Murina SAH modeller är ett viktigt verktyg för SAH grundforskning. Cerebral vasospasm används ofta som en slutpunkt i experimentella studier som undersöker de mekanismer som leder till DCI efter SAH9,11. Kvantifiering av cerebral vasospasm hos möss eller andra små djurmodeller av SAH emellertid utmanande. Vanligen, kvantifieras vasospasm genom ex vivo bestämning av fartyget diametrar på definierade anatomiska punkter efter endovaskulär perfusion och gjutning7,9,12 eller genom bestämning av omkretsen definierade fartyg på histologiska avsnitt10,11. Dessa metoder har dock vissa nackdelar: Vasospasm utvärderas på definierade anatomiska ställen; vasospasm på angränsande fartygssegment kan undgå utvärdering. Histologiska artefakter presenterar en annan källa till fel. Utvärderingen kan dessutom vara ganska subjektiva, eftersom den exakta positionen där fartyget diametern mäts bestäms av prövaren.
Målet var därför att fastställa en metod som kvantifierar cerebral vasospasm genom beräkning av fartyget volymen av hela cerebral fartygssegment från tvärsnittsdata imaging data7. Den viktigaste fördelen av volymkontrollmetoden som presenteras här är hela fartyget segment kan undersökas. Detta undviker behovet av definitionen av en punkt där fartyget diameter mäts. En ytterligare fördel med utvärderingen av hela fartygssegment är att det förmodligen innehåller en mer objektiv parameter för att kvantifiera vasospasm än bestämning av fartyget diametrar på definierade punkter där vasospasm mer proximala eller distala fartygets kan fly utvärdering. Digital representation av fartyget diametrar med en färgkod tillåter en intuitiv uppskattning av graden av vasospasm. Dessutom leder volymetriska utvärdering till större skillnader mellan vasospastisk fartyg jämfört med utvärdering av fartyget diametrar som visas i de representativa resultat. Virtuella återuppbyggnaden uppnås med metoden presenteras här återspeglar den vaskulära anatomin korrekt. Detta framgår av utvärderingen av representativa serien, i vilka kärl diametrar mätt mikroskopiskt och från de digitala rekonstruktionerna var liknande, reproducera observationerna av en tidigare studie7. Men trots sina fördelar behövs ytterligare studier för att utvärdera huruvida metoden presenteras här är överlägsen konventionella metoder för vasospasm analys.
En begränsning av den metod som presenteras här är att det ger mer tid jämfört med Mikroskopisk analys av gjuten hjärnan prover eller histologiska (micro CT scanning tid 90 minuter per hjärnan prov, databehandling 45 min per hjärnan prov). Tillgängligheten av micro CT scanners kan dessutom begränsa dess användning. Antalet djur undersökt här var tillräcklig för att demonstrera genomförbarheten av det protokoll som beskrivs i detta manuskript. Dock om protokollet bör användas i behandlingsstudier, baserat djur nummer skulle behöva beräknas på de förväntade effekterna på fartyget volymer och diametrar. En annan begränsning av denna och andra studier murina SAH-modeller är att vasospasm är beslutsam ex vivo. Detta gör longitudinella studier omöjligt att undersöker originalplansvärden innan SAH induktion och vasospasm vid olika tidpunkter. Även om studier har visat att det är möjligt att skildra de stora intrakraniella kärl av möss i vivo som med magnetisk resonans tomografi18, datortomografi angiografi19eller digital subtraktion anatomi angiografi20, dessa metoder, att vår kunskap, har ännu inte använts att analysera cerebral vasospasm i murina SAH modeller i vivo. Notera är den digital rekonstruktionen av det cerebrala kärl med efterföljande volymetriska utvärdering av cerebral vasospasm som presenteras här inte begränsat till användning på ex vivo micro CT data. Om hög upplösning vaskulär cross sectional hjärnavbildning hos möss blir tillgängliga i framtiden, kan det användas för att utföra en volymetrisk analys av vasospasm i vivo.
The authors have nothing to disclose.
Delar av denna studie är en del av doktorsavhandlingen av T. Pantel, presenteras för den medicinska fakulteten av Johannes Gutenberg-universitetet i Mainz. Studien har finansierats genom den Friedhelm frigör Stiftung och den Stiftung Neurochirurgische Forschung (bidrag till A.N.).
Medetomidin | Pfizer, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
Midazolam | Ratiopharm, Ulm, Germany | n.a. | |
Fentanyl | Curamed, Karlsruhe, Germany | n.a. | |
Venofix 21G | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | n.a. | 21G cannula |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline containing MgCl2 and CaCl2, pH 7.4 | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | D8662 | |
4% paraformaldehyde solution | Sigma-Aldrich, Hamburg, Germany | 100496 | |
Microfil MV-122 | Flowtech Inc., Carver, MA, USA | n.a. | Radiopaque |
Micro-CT system Y.Fox | Yxlon, Garbsen, Germany | n.a. | |
Reconstruction Studio software version 1.2.8.1 | TeraRecon, Frankfurt am Main, Germany | n.a. | Reconstruction software |
Amira software version 5.4.2 | FEI Visualization Sciences Group, Hillsboro, OR, USA | n.a. | Visualization software |
PHD ultra syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3 | Pressure controlled pump |
anatomical forceps (blunt) | B Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany | 160323_v | |
Infinity X-21 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | high resolution camera |
DeltaPix Insight software version 2.0.1 | Deltapix, Maalov, Denmark | n.a. | |
C57BL6 mice | Charles River, Cologne, Germany |