Her præsenterer vi en protokol for benchtop immobiliseret metal affinitet kromatografi rensning og efterfølgende rekonstituering af en polyhistidine, der er markeret, ikke-hæm jern bindende dioxygenase egnet for undergraduate undervisning laboratorium.
Benchtop immobiliseret metal affinitet kromatografi (IMAC), af polyhistidine markeret proteiner er let masteret af bachelorstuderende og er blevet den mest anvendte protein oprensning metode i den moderne litteratur. Men anvendelsen af affinitet kromatografi til metal bindende proteiner, især dem med redox følsomme metaller som jern, er ofte begrænset til laboratorier med adgang til en handske boks – udstyr, ikke der er rutinemæssigt rådighed i the bachelor laboratorium. I denne artikel vil vise vi vores benchtop metoder til isolering, IMAC rensning og metal-ion rekonstituering af en poly-histidin markeret, redox-aktive, ikke-hæm jern bindende extradiol dioxygenase og analyse af dioxygenase med varieret underlag koncentrationer og mætte ilt. Disse metoder er udført af studerende og implementeret i undergraduate undervisning og forskning laboratorium med instrumentering, som er tilgængelige og økonomisk overkommelige på primært bachelor institutioner.
De første rapporter om rensning af et polyhistidine markeret protein fra uddrag af en værtsorganisme, ved hjælp af Chelat histidin tag af et immobiliseret metal ind i litteratur i 19881,2. Siden dengang, tilsætning af polyhistidine tags rekombinante proteiner og deres rensning af immobiliserede metal affinitet kromatografi (IMAC) har blive næsten allestedsnærværende i den biokemiske litteratur3,4, 5. IMAC rensning metoder kan gennemføres på benchtop, ved hjælp af automatiserede kromatografi og i spin-kolonne formater. Mens affinitet rensning metoder, især IMAC, er meget udbredt i forskningslaboratorium, er de mindre udbredt i undergraduate undervisning laboratorium. De mest udbredte laboratorium lærebøger for biokemi laboratorium lære ikke rutinemæssigt disse metoder, i stedet vælger mere traditionelle ionbytning eller farvestoffet-bindende kromatografi6,7,8 , 9. For eksempel rensning af laktat dehydrogenase af Anderson10 bruger affinitet af farvestoffet-bindende, og rensning af komælk α-lactalbumin7,11 af Boyer bruger en nikkel-nitriloacetic syre matrix, men ingen rekombinant poly-histidin tag, i stedet afhængige iboende affinitet af proteinet for harpiks. Nogle moderne bachelor laboratorium lærebøger og publikationer gennemfører immobiliseret metal affinitet kromatografi på poly-histidin markeret protein mål såsom grønt eller rødt-fluorescerende proteiner12,13, 14,15, antistoffer16og udvalgte enzymer17,18,19,20, selv nogle af ukendt funktion21. Velsagtens, rensning af et enzym er at foretrække i undervisningen laboratorium, fordi målet kan analyseres for aktivitet i efterfølgende sessioner, berige oplevelsen af “virkelige videnskab” hos studerende; disse typer af laboratoriet erfaringer er blevet offentliggjort, og gavnlige resultater på elevernes læring rapporteret17,18,20,21. Og endnu, anvendelser af IMAC til enzym rensning i biokemi undervisning laboratorium fortsat er sparsom, og de offentliggjorte metoder kan endda formoder adgang til kromatografi instrumentation, der er typisk ikke tilgængelig for brug i klasseværelset laboratorium 20. der er også begrænsninger i anvendelsen af IMAC på metalloproteins, især dem, som binder redox-følsomme divalent metaller, der er afgørende for aktivitet22. Ofte, er metal-ion mistet eller oxideret under rensningen giver en inaktiv enzym dårligt egnede til bachelor laboratoriet.
En fuld tredjedel af enzymer binder en metal-ion23, og trods en næsten universel forudsætning for jern i alle former for liv23, jern er uden tvivl blandt de mest problematiske metalioner i enzymology. Non-hæm Fe2 + bindende enzymer er særligt tilbøjelige til tab og/eller oxidation af metal under IMAC; formentlig på grund af manglende en dedikeret økologisk ligand som hæm og den lethed, med hvilken Fe2 + kan tage afstand fra aminosyren ligander24. Derudover er ilt afhængige oxidation af Fe2 + til Fe3 + spontan i vandig opløsning, på grund af negative fri energi ændringen og den relative stabilitet af Fe3 +. Ofte, overvinde disse udfordringer ved brug af anaerobe atmosfære og/eller ikke-IMAC kromatografiske metoder22. I denne artikel vil vi demonstrere brugen af benchtop IMAC til at rense de Fe2 + afhængige metalloenzyme L-DOPA dioxygenase ved hjælp af enkle, billige kromatografi forsyninger, efterfulgt af opløsning af det aktive sted Fe2 +, og enzymatisk assay. Disse metoder er standard i vores egen bachelor biokemi laboratorium af 6-12 grupper af studerende og kan bruges til at udvide repertoiret af enzymet undersøgelser på bachelor-niveau.
Mens tilføjelsen af polyhistidine tags rekombinante proteiner og deres rensning af IMAC er blevet næsten allestedsnærværende i den biokemiske litteratur3,4,5, anvendelser af IMAC til enzym rensning i biokemi undervisning laboratorium fortsat er sparsom, og offentliggjort metoder mener ikke altid resource begrænsninger af undervisningen laboratorium20. Desuden er brug af IMAC i undervisningen laboratorium mest effektiv, når koblet til eksperimenter, der vurderer aktivitet og renhed, at gøre IMAC rensning af et enzym en ideel instruktions aktivitet. For at udvide anvendelsen af IMAC til rensning af enzymer, herunder metalloenzymer, i undervisningen laboratorium, er pålidelige og billige metoder nødvendige. I denne protokol, vi vise benchtop IMAC ved hjælp af let tilgængelige og billige laboratorie forsyninger, samtidig tage fat begrænsninger i anvendelsen af IMAC på metalloproteins22, af erstatningsgodtgørelse Aluminiumacetat afhængige metalloenzyme, L-DOPA dioxygenase, bogføre rensning. Ved hjælp af reagenser og materialer beskrevet, anslår vi forbrugsmaterialer til otte grupper af studerende koster mellem $500-600 pr. semester til at køre denne protokol, herunder analyse trinene i figur 1 og figur 2.
På grund af den lethed, hvormed Fe2 + kan tage afstand fra aminosyren ligander24 og letkøbt oxidation af Fe2 + O2 til Fe3 +, rekonstituering af ikke-hæm, er aminosyre-Chelateret Aluminiumacetat i en rekombinante metalloenzyme et typisk komponent af enzymet rensning. Når klassisk kromatografi bruges, er det muligt at undgå samlede tab af jern i nogle tilfælde32, men oftere, jern (II) er tilføjet tilbage i overværelse af reduktionsmiddel33,34,35, 36 ofte under en anaerob atomosphere37,38,39, og i nogle tilfælde den overskydende jern ikke er fjernet33,34,36, komplicerende enhver efterfølgende analyse. På hinanden følgende trin af klassisk kromatografi og en anaerob atmosfære er ikke realistisk for undergraduate laboratoriet, hvilket fik udviklingen af denne protokol.
Mens den manuelle forberedelse af kolonnen Ni-NTA og behandling af prøver i vid udstrækning af tyngdekraften tager ekstra tid og kræfter når sammenlignet med pre-pakkede kolonner og automatiseret kromatografi instrumentation, mulighed de manuelle trin hands-on at lære de studerende, der resulterer i øget forståelse for videnskaben bag processen. Tilsætning af jern (II) salt på betingelser beskrevet her er særligt følsomme over for overskydende dithiothreitol. Hvis en studerende fejlagtigt tilføjer et overskud af dithiothreitol, er en nedbør begivenhed sandsynligt. Vi har fundet det nyttigt at kræve studerende til at udføre beregninger af reagens mængder før ankommer i lab, så laboratorium tid kan udnyttes mest effektivt på bænken. Hele benchtop IMAC rensning – fra celle-lysis til protein eluering – kan ske i en periode på 4 timers laboratorium, efterfulgt af rekonstitution og analysen i en efterfølgende lab periode.
The authors have nothing to disclose.
Denne publikation er baseret på arbejde støttet af National Science Foundation under Grant nr. CHE 1708237.
consumables | |||
BeadBeater 0.1mm glass beads | BioSpec Products | 11079101 | 1 pound each |
50mL Conical Tubes with Screw Caps, sterile | VWR | 21008-178 | |
Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
Potassium phosphate, monobasic | Acros (Fisher) | AC42420-5000 | |
Sodium Ascorbate | Acros (Fisher) | AC35268-1000 | |
DTT (Dithiothreitol) | Lab Scientific | D-115 | |
Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigmaaldrich | 310077 | |
HisPur NiNTA Resin | Fisher (pierce) | PI88221 | |
Econo-Column Chromatography Columns – 1.5 x 20cm | Bio-Rad | 737-1522 | 1.5 x 20 cm, 35 ml, 2ea, |
Stopcock Valve, one way, female to male luer | Kimble | 420163-0000 | pack of 50 |
BD 10mL luer-loc syringe (non-sterile, without needle) | VWR | 301029 | |
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Female Luer | Biorad | 7318222 | |
Fitting for tubing: 1.6 mm Barb to Male Luer | Biorad | 7318225 | |
Silicon Tubing (1.6 mm ID/0.8 mm wall, for 0.2-5 ml/min on Peristaltic Pump) | Bio-Rad | 7318211 | Pkg of 1, 1.6 mm ID/0.8 mm wall, 10 m, low-pressure tubing for liquid handling |
Glycerol | Fisher (Pierce) | 17904 | |
Coomassie Plus (Bradford) Protein Assay | Thermo Scientitic | 23236 | |
Microcentrifuge Tubes, snap cap, 1.5mL | VWR | 89000-028 | |
Fisherbrand polystyrene disposable serological pipets | Fisher | 13-676-10F | |
Fiserbrand universal pipet pump | Fisher | 14-955-110 | |
Fisherbrand Transfer Pipets | Fisher | 13-711-9AM | |
Econo-Pac 10DG desalting columns | Bio-Rad | 732-2010 | box of 30 |
ExpressPlus PAGE 5x sample buffer | Genscript | MB01015 | 5mL (Dilute 1:5 with sample) |
ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 wells | Genscript | M42012 | 20 gels |
Fisherbrand Disposable Cuvettes, Methyacrylate | Fisher | 14-955-128 | case of 500 |
Cuvette Caps Square Disposable | Fisher | 14-385-999 | |
L-DOPA (3,4-dihydroxyphenylalanine) | Acros | D9628-5G | |
Permanent Equipment: | |||
BeadBeater 50mL chamber | BioSpec Products | 110803-50SS | 1 chamber |
BeadBeater | BioSpec Products | 1107900-101 | 350 ml polycarbonate chamber, rotor assembly, motor base, ice-water cooling jacket and one pound of glass beads. |
Centrifuge tubes, High-Speed PPCO, 50mL | Fisher | 3119-0050PK | |
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad | 1658004 | 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam |
PowerPac HC Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | 100–120/220–240 V, power supply for high-current applications, includes power cord |
UV-1800 with UV-Probe Software | Shimadzu | UV-1800 | |
Kintek Global Kinetic Explorer | Kintek Corp | version 6 | https://www.kintekexplorer.com/downloads/ |