전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함) HIV-1 proviruses 근처의 시퀀싱에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법 제공 하 고 그들의 잠재력의 결정에 대 한 허용 복제-역량입니다. 튀기기 잠재 HIV-1 저수지 시퀀싱 하도록 분석 하는 이전 실험의 한계를 극복 한다.
Full-Length 개별 Proviral 시퀀싱 (뒤집기) 분석 결과 증폭 및 단일 전체 길이 (손상 및 결함), 에이즈-1 proviruses 근처 시퀀싱 하도록 설계 된 효율적이 고 높은 처리량 방법입니다. 넘겼습니다 셀 인구 내의 통합된 에이즈-1의 유전자 구성의 결심을 허용 한다. 반전 녹음 방송, 큰 내부 삭제, 같은 기간 동안 발생 하는 에이즈-1 proviral 시퀀스 내에서 결함 식별을 통해 해로운 정지 codons/hypermutation, frameshift 돌연변이 및 cis 요소 행동 돌연변이/삭제 필요 virion 성숙에 대 한 뒤집기 통합된 proviruses 복제의를 식별할 수 있습니다. 에이즈-1 proviruses는 이러한 결함을 부족 하 고 따라서 잠재적으로 복제 유능한 식별을 넘겼습니다 분석 결과 활용할 수 있습니다. 넘겼습니다 프로토콜 포함: 에이즈-1 감염 된 세포의 세포 전체 길이 HIV-1 proviruses 근처의 PCR 중첩 (에이즈-1 5를 타겟으로 하는 뇌관을 사용 하 여 ‘ 3 ‘ LTR), DNA 정제, 정량화, 도서관 준비 위한 차세대 시퀀싱 (NGS), NGS, 드 노 보 조립 proviral contigs 및 복제 유능한 proviruses 식별에 대 한 철폐의 간단한 과정. 뒤집기 순서를 설계 하는 전통적인 방법에 비해 장점이 통합 단일 proviral 시퀀싱 등 에이즈-1 proviruses을 제공 합니다. 넘겼습니다 증폭 및 결정, 되도록 복제 능력을 사용 하는 전체 길이 proviruses 근처 시퀀스 고 또한 적은 증폭 뇌관, 뇌관 불일치의 결과 방지를 사용 합니다. 그러나 튀기기 잠재 저수지 내 특히 통합된 HIV-1 proviruses의 유전 프리를 이해 하기 위한 유용한 도구입니다, 그리고, 그것의 사용 있는 통합된 에이즈-1의 유전자 조성은 필요한 모든 응용 프로그램을 확장할 수 있습니다.
장기 투여 치료 (미술)에 개인에 속하는 잠재 HIV-1 저수지의 유전 특성 이해는 통합된 proviruses의 대부분은 결함이 있는 복제 무능1 에 중요 한 되었습니다. , 2. 반전 녹음 방송 과정에서 오류 통합된 proviral 시퀀스에 소개 된다. 결함이 proviral 시퀀스를 생성 하는 몇 가지 메커니즘 등 오류 발생 hiv-1 역전사 효소3,4및 APOBEC 유도 hypermutation5,6스위칭 템플릿. 두 개의 최근 연구 에이즈-1 proviruses 장기 예술에 개인에서 고립의 약 5% 유전자 그대로, 그리고 잠재적으로 복제 유능한, 그리고 예술의 정지시 에이즈-1 플라스마 수준에 빠른 리바운드에 기여할 수 있습니다 나타났습니다. 1 , 2 , 7. 이전 연구 복제 유능한 HIV-1 proviruses 순진한 및 메모리 CD4 휴식 유지 확인+ T 세포 부분 집합 (를 포함 하 여 중앙, 전환 및 효과 기 기억 T 세포)의 중요성을 나타내는 이 대상으로 미래에 박멸 전략2,,89세포.
배포, 역학 및 잠재 HIV-1 저수지의 유지 보수에 초기 통찰력 유전자 hiv-1 게놈10 의 하위 게놈 영역을 특징 짓는 단일 proviral 시퀀싱 (SPS) 방법의 활용을 통해 달성 했다 11,,1213. SPS는 단일 감염 된 세포 내에서 단일 HIV-1 provirus 시퀀싱 수 다재 다능 한 도구입니다. 그러나, SPS는 그것만 뇌관 바인딩 사이트 내의 큰 삭제를 포함 하는 하위 게놈 영역 및 누락 proviruses 시퀀스 이후 proviruses의 복제 능력을 확인할 수 없습니다. 이전 연구는 SPS에 의해 복제 유능한 저수지의 크기를과 대 평가 설명 했다 13-에 17 배 그대로 하위 게놈 영역2를 선택적으로 시퀀싱을 통해.
SPS, 호 외. 의 한계를 해결 하기 위해 4 와 브루 너 외. 1 전장 HIV-1 proviruses 근처 시퀀스 분석 실험을 개발 했다. 이 결정 장기 예술에 개인 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한, 에이즈-1 proviruses의 주파수를 허용. 이 분석 실험 증폭 및 시퀀싱 (통해 생어 시퀀싱) 하위 게놈 영역을 다음 순서는 그대로 (결함)의 HIV-1 provirus를 조립 했다. 이 방법의 세 가지 한계는: 1) 여러 시퀀싱 뇌관의 사용 실수로 proviral 시퀀스에 결함을 도입의 위험을 증가, 2) 뇌관 불일치 증폭 되지 않을 수 있습니다 특정 proviruses의 그리고 3) 자주는 이러한 방법 전문적으로 전체 proviral 시퀀스를 확인할 수 없습니다.
기존 전장 HIV-1 proviral 시퀀싱 분석 실험의 한계를 극복 하기 위해 우리는 F펼-Length 나ndividual P Sroviral equencing (뒤집기) 분석 결과를 개발 했다. 튀기기는 차세대 시퀀싱 (NGS)-증폭 하 고 높은 처리량 및 효율적인 방식으로 전체 길이 (그대로 또는 결함) HIV-1 proviruses 근처 시퀀스 기반된 분석 결과. 넘겼습니다 활용; 뇌관의 수를 제한 하는 그것으로 이전 분석 실험, 이점을 제공 한다. 따라서, 그것은 불일치, proviruses의 인구를 제한할 수 있습니다 캡처 또는 실수로 바이러스 시퀀스에 결함을 소개 하는 뇌관의 기회를 줄인다. 군요 이전 분석 보다 적게 기술적으로 도전적인 또한 및 6 단계를 포함 한다: 1) 에이즈-1 감염의 세포 세포, 2) 증폭 중첩된 PCR 뇌관 특정 높은 보존에 대 한 사용 하 여 희석을 제한에서 수행을 통해 단일 HIV-1 proviruses HIV-1 5’과 3′ U5 LTR 영역 (그림 1A), 3) 정화 및 증폭된 제품, 4의 정량화) NGS, 5에 대 한 증폭 된 proviruses의 도서관 준비) NGS, 6) 각 contigs를 시퀀스 proviruses의 드 노 보 조립 개별 provirus입니다.
튀기기에 의해 생성 된 시퀀스 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한 (그림 1C)2인 그들을 식별 하는 제거의 엄격한 과정을 받을 수 있습니다. 유전자 그대로 proviruses 복제 무능 provirus의 세대에서 발생 하는 모든 알려진된 결함 부족 합니다. 이러한 결함 포함: 반전 시퀀스, 대형 내부 삭제, hypermutation/해로운 정지 codons, frameshifts, 또는 변이 5′ 신호 또는 포장 결합 기증자 (MSD) 사이트.
그림 1: 전체 길이 개별 proviral 시퀀싱 (뒤집기) 분석 결과에 중요 한 단계. (A) 5′ 그리고 3′ U5 LTR 지역 중첩된 PCR 통해 전체 길이 (불완전 하 고 그대로) HIV-1 proviruses 근처 증폭 튀기기에서 사용 뇌관 바인딩 사이트와 에이즈-1 DNA 게놈. (B) 레이아웃 잘 80 샘플 웰 스 (각 희석에 대 한 20 웰 스), 4 부정적인 제어 우물, 그리고 1 긍정적인 통제를 포함 하는 96-잘 PCR 격판덮개의. (C) 유전자 그대로 하 고 잠재적으로 복제 유능한, 에이즈-1 proviruses를 식별 하는 데 사용 하는 제거의 과정. 이 그림 Hiener 그 외 여러분 에서 수정 되었습니다. 2 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
튀기기 분석 결과 증폭 및 시퀀싱 단일, 전체 길이 HIV-1 proviruses 근처에 대 한 효율적이 고 높은 처리량 방법입니다. 여러 요소 및 프로토콜에서 번호와 얻은 시퀀스의 품질에 영향을 주는 중요 한 단계 확인 되었습니다. 첫째, 세포 수와 세포 인구의 에이즈-1 감염 주파수 증폭 하는 proviruses의 수에 영향. 예를 들어 이전 간행물에서 약 절반 만큼 시퀀스는 같은 수의 순진한 CD4+ T에서 입수 했다 effector 메모리 CD4에 비해 셀+ T 세포. 이것은 순진한 세포는 일반적으로 이펙터 메모리 셀2보다는 낮은 감염 주파수를가지고 있기 때문 에입니다. 둘째, 세포 세포 DNA 추출 과정에서 손실의 아무 위험으로 게놈 DNA를 얻기 위해 열 기반 추출 방법 바람직합니다. 마지막으로, 어떤 PCR 기반 분석 결과와 마찬가지로 오염 예방이 중요 합니다. 분리 된 깨끗 한 영역 마스터 믹스, genomic DNA, 긍정적인 컨트롤, DNA 정제, 정량화, 및 라이브러리 준비 추가 처리를 준비 하기 위한 지정 해야 합니다. 이것은 여기에 제시 된 것과 같은 단일-사본을 분석 실험을 위해 특히 중요 하다입니다.
튀기기 분석 결과의 구현 처음 참가자 샘플 보다는 pNL4 3 플라스 미드와 같은 긍정적인 컨트롤 실행 포함 해야 합니다. 얻은 시퀀스가 플라스이 미드에 대 한 사용 가능한 참조 시퀀스에 비해 수 있습니다 이것은 모든 문제 해결 이전에 에이즈-1 긍정적인 세포의 사용에 대 한 허용 됩니다. 에이즈-1 긍정적인 세포를 사용 하는 경우 그것은 거의 아무 proviruses 증폭 됩니다 경우 에이즈-1 subtype (뇌관 넘겼습니다 하위 B에 대 한 설계) 및 세포 인구의 감염 빈도 고려 하는 것이 중요. 뇌관 시퀀스 수정/다른 하위에 맞게 재설계 될 수 있습니다. 또한, 긍정적인 통제를 포함 하는 잘 모든 PCR 수행에 포함 되어야 합니다.
튀기기는 SPS를 포함 하 여 이전 시퀀싱 분석의 한계를 극복 했다. 증폭 및 전체 길이 HIV-1 proviruses 근처 시퀀싱을 통해 넘겼습니다 에이즈-1 proviruses의 잠재적인 복제 역량을 확인할 수 있습니다. 이것은 SPS 하위 게놈 영역만을 시퀀싱 하 고 따라서 시퀀스를 그대로 뇌관 바인딩 사이트 선택을 사용 하 여 이었다. 또한, 넘겼습니다 활용 하 여 여러 증폭 및 시퀀싱 뇌관, 이전 전장 시퀀싱 분석1,4에 의해 고용 되었다와 관련 된 한계 극복. NGS와 함께 HIV-1 LTR 영역을 대상으로 하는 PCR의 2 라운드를 통해 넘겼습니다 수와 필요한 뇌관의 복잡성을 줄입니다. 튀기기 적습니다 뇌관 불일치, 즉 결함이 있는 proviruses의 잘못 된 식별 및 인구 내의 몇 가지 proviruses을 증폭 하는 무 능력의 결과에 따라서 이다. 넘겼습니다 프로토콜 더 효율적 이며 또한 이전 방법 보다 시퀀싱의 높은 처리량에 대 한 수 있습니다.
결국, 화나게 하다 에이즈-1 proviruses의 유전적 구성을 결정 하는 기존 방법에 비해 이점이 있습니다. 그러나, 그것은 튀기기의 한계를 인정 하는 것이 중요입니다. 첫째, 넘겼습니다 분석 결과 하지 개발 되었습니다 잠재 HIV-1 저수지의 크기를 측정 하기 위한 도구로 넘겼습니다 세포 인구에 있는 모든 HIV-1 provirus 증폭 여부를 결정 하는 분석 완료 하지 않은. 튀기기는 대신 다른 세포 인구2사이 저수지의 구성의 상대 비교를 만들기 위한 유용 합니다. 둘째, 그대로 HIV-1 proviruses의 복제 능력 vivo에서 , 같은 분석 호 외. 수행 없이 확실 하 게 확인할 수 없는 4. 셋째, 화나게 하다 에이즈-1 proviruses의 통합 사이트를 확인 하도록 설계 되지 않았습니다.
넘겼습니다 프로토콜에 작은 변이 응용 프로그램을 늘릴 수 있습니다. 예를 들어 시퀀스 다른 수 뇌관 및 증폭 하 여 시퀀싱 여러 에이즈-1 하위에서 변경 합니다. 플라즈마 1 HIV virions의 시퀀싱 중첩된 PCR 이전 cDNA 합성의 추가 통해 가능 하다. 단일 분자 시퀀싱 방법의 미래 활용 드 노 보 어셈블리에 대 한 필요성을 제거 합니다.
통합된 HIV-1 proviruses의 유전자 시퀀싱 잠재 HIV-1 저수지의 우리의 이해를 증가 했다. 튀기기 elucidating 구성과 잠재 저수지의 미래 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 그러나, 뒤집기의 응용 프로그램은 저수지 넘어 확장할 수 있습니다. 미래 연구 넘겼습니다 CRISPR Cas 기술에 대 한 특정 목표를 결정 하거나 코딩의 식별에 사용할 수 및 비 코딩 영역 바이러스를 에이전트를 반전 하는 대기 시간을 더 응답 하 게 만들기. 바이러스 성 재결합 큰 내부 삭제의 접합 사이트를 보면 더 이해 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작업을 지원 했다 (1U19AI096109와 1UM1AI126611-01); 치료법을 찾을 Delaney 에이즈 연구 기업 (감히) 자선단체 에이즈 연구 (amfAR 108074-50-RGRL);는 재단에서 에이즈 퇴치 (ARCHE) 공동 연구 그랜트에 연구 컨소시엄 호주 센터 에이즈 및 간염 바이러스학 연구 (ACH2); UCSF GIVI 센터 에이즈 연구 (P30 AI027763); 그리고 호주 국가 건강과 의료 연구 위원회 (AAP1061681). 우리 박사 조이 라이, 웨스트 미드 연구소 도서관 준비 및 그의 시설 사용에 그의 훈련에 대 한 의학 연구에 대 한 게놈 시설 관리자와 Ramaciotti 센터 유전체학 (대학의 뉴 사우스 웨일즈, 시드니, 호주)에 대 한 감사 하 고 싶습니다. 시퀀싱을 진행 하는 방법에 대 한 우리는 감사와 함께이 연구에 대 한 샘플을 기증 참가자 인정.
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | Dilute to 5 mM for nested PCR |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma | 98379 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL) | Promega | AM2548 | |
96 well thermocycler | Any 96 well thermocycler can be used | ||
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
10X High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] | Invitrogen | 11304011 | |
50 mM MgSO4 | Invitrogen | 11304011 | |
PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | C1141 | |
Ultrapure H2O | Invitrogen | 10977023 | |
PCR1 and PCR2 Primers | Desalted. Dilute to (100 M) with H2O | ||
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | BioRad | MSB1001 | Required to seal 96 well PCR plates |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). | Diluted to 10^5 copies/mL and used as positive control | |
PCR plate spinner or benchtop centrifuge | |||
E-GEL 48 1% Agarose | Invitrogen | G800801 | Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide. |
DirectLoad Wide Range DNA Marker | Sigma | D7058 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
Mother E-Base device | Invitrogen | EBM03 | Required for running precast 48 well 1% agarose gels |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used |
PlateMax Peelable Heat Sealing | Axygen | HS-200 | Heat sealing film for long term storage |
96 Well 0.8 mL Storage Plate | ThermoFisher Scientific | AB0765 | 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification |
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) | Beckman Coulter | A63880 | Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106) |
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology | Sigma | E7023 | |
Magnetic Stand-96 | Invitrogen | AM10027 | |
Microplate shaker | Optional | ||
Buffer EB | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
Microplate reader | |||
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-2001 | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Biorad | HSP9601 | Required for Nextera XT DNA library preparation kit |
Library Quantification Kit – Illumina/Universal | Kapa Biosystems | KK4824 | Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029) |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technology | Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit | |
High Sensistivty DNA kit | Agilent Technology | 5067-4626 | |
Illumina MiSeq Platform | Illumina |