הערכה תפקודית של חוש הריח מסלולים ב ראשנים של צפרדע רפואית חי
Summary
ראשנים של צפרדע רפואית להציע פלטפורמה ייחודית לחקור את תפקוד מערכת העצבים ויוו. אנו מתארים מתודולוגיות להערכה של עיבוד מידע חוש הריח חי צפרדע רפואית הזחלים בתנאים נורמליים לגידול או לאחר פגיעה.
Abstract
ראשנים של צפרדע רפואית להציע פלטפורמה ייחודית לחקור את תפקוד מערכת העצבים. הם מספקים יתרונות ניסיוני מרובים, כגון נגישות רבות הדמיה גישות, שיטות אלקטרופיזיולוגיות של מבחני התנהגות. מערכת הריח של ראשן צפרדע רפואית מתאימה במיוחד כדי לחקור את הפונקציה של הסינפסות הוקמה במהלך התפתחות נורמלית או רפורמה לאחר פציעה. כאן, אנו מתארים מתודולוגיות להערכה של עיבוד מידע חוש הריח חי צפרדע רפואית הזחלים. אנחנו חלוקה לרמות בשילוב של מדידות ויוו של סידן presynaptic תגובות ב glomeruli של הנורה הריח עם מבחני התנהגות מונחות על חוש הריח. ניתן לשלב שיטות חיתוך של הריח עצבים לומד הטיפולי של קישוריות סינפטית. ניסויים מוצגים באמצעות בעלי חיים פראי-סוג והן מהונדס גנטית, המבטאת GFP כתבים תאי מערכת העצבים המרכזית. יישום גישות תיאר ראשנים מהונדסים יכול להיות שימושי עבור להתיר היסודות המולקולריים המגדירים את התנהגות חוליות.
Introduction
צפרדע רפואית ראשנים מהווים מודל חיה מצוינת ללמוד על תפקוד תקין של מערכת העצבים. שקיפות, הגנום במלואו ברצף1,2וכן נגישות כירורגי, אלקטרופיזיולוגיות טכניקות הדמיה הם מאפיינים ייחודיים של הזחלים צפרדע רפואית לאפשר חקירת עצביים פונקציות ויוו3 . חלק מהאפשרויות ניסיוני מרובים של מודל זה בעל חיים מומחשים על ידי מחקרים יסודיים מתבצע על ראשן ורפלקסי מערכות4,5,6. מעגל עצביים במיוחד מתאים היטב ללמוד היבטים רבים של מידע עיבוד ברמה של הסינפסות היא מערכת הריח ראשן צפרדע רפואית 7. ראשית, קישוריות סינפטית שלה היא מוגדרת היטב: קולטני ריח נוירונים (ORNs) פרוייקט הנורה הריח ולבסס קשרים סינפטיים עם דנדריטים של המסתם הדו-צניפי/מצויץ תאים בתוך glomeruli ליצירת מפות ריח. שנית, ORNs שלה ברציפות מופקים על ידי נוירוג’נסיס לאורך החיים כדי לשמור את הפונקציונליות של מסלולים חוש הריח8. שלישית, כי מערכת הריח מראה יכולת ההתחדשות הגדול, ראשנים של צפרדע רפואית הם מסוגלים לחלוטין רפורמה הנורה הריח שלהם אחרי אבלציה9.
בנייר זה, אנו מתארים גישות לשלב הדמיה של חוש הריח glomeruli ב ראשנים חיים עם ניסויים התנהגותיים ללמוד את הפונקציונליות של מסלולים חוש הריח. השיטות שתוארו כאן שימשו כדי ללמוד התאוששות פונקציונליות של קישוריות glomerular בהנורה הריח אחרי חיתוך עצב הריח10. נתונים שהושגו ב ראשנים של צפרדע רפואית הם נציג של חולייתנים מאז עיבוד חוש הריח הוא אבולוציוני והתפאורה.
בשיטות המתוארות הן ביטוי באמצעות X. tropicalis , אבל הם בקלות ניתן ליישם ב- X. זריזה. למרות גודל גדול יותר מבוגר X. laevis, שני המינים דומים בשלבים ראשן. ההבדלים העיקריים לשכון באותה רמת גנומית. X. laevis מציג ללקוחות שלנו גנטי המסכן, נקבע בעיקר על ידי הגנום allotetraploid שלה ואת משך זמן דור (כ- 1 שנה). לעומת זאת, X. tropicalis הוא נוטה יותר שינויים גנטיים בשל זמן דור קצר (5-8 חודשים) שלה הגנום דיפלואידי. הניסויים נציג מומחשים חיות פראי-סוג, שלושה קווים הטרנסגניים שונים: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis), tubb2:GFP (X. laevis).
למתודולוגיות המתוארים העבודה הנוכחית להתייחס לצד התקדמות גנטי בתחום צפרדע רפואית . הפשטות ואת יישום קל של טכניקות הציג הופך אותם שימושי במיוחד להערכת מוטציות שתואר כבר11, כמו גם קווי צפרדע רפואית שנוצרו על-ידי טכנולוגיית CRISPR-Cas912. אנו מתארים גם הליך כירורגי נהגה transect עצבי הריח זה יכול להיות מיושם במעבדה כל גישה ראשנים של צפרדע רפואית . הגישות המשמש להערכת תגובות סידן presynaptic, התנהגות מונחות על חוש הריח דורשת ציוד ספציפי, אמנם לרשותכם קו מתון עלתה. מתודולוגיות מוצגים בצורה פשוטה על מנת לקדם את השימוש בקבוצות מחקר, אפשר להגדיר הבסיסים של מבחני מורכב יותר או על-ידי הטמעת שיפורים או על ידי האגודה טכניקות אחרות, קרי, היסטולוגית או מחלה גנטית גישות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מתאר טכניקות שימושיות לחקור את הפונקציונליות של חוש הריח מסלולים חי ראשנים של צפרדע רפואית . בפרוטוקול הנוכחי שימושי במיוחד עבור מעבדות האלה לעבוד, או גישה צפרדע רפואית; עם זאת, זה גם מעניין עבור אלה החוקרים ללמוד הבסיסים תאית ומולקולרית של התחדשות עצביים ותיקון. התוצאות …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים y El Ministerio de Economía Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofunded על ידי אירופה אזורי פיתוח קרן (ERDF), על ידי פרסי מחקר תחרותיים מן האחווה מ ג פ Fuortes ממוריאל, סטיבן. וו קופלר במלגת הקרן, לורה ו ארתור Colwin ניחן הקיץ מלגת קרן מחקרים , המשפחה Fischbach, קרן דור גדול של מעבדה ביולוגית ימית, את נבחרת צפרדע רפואית משאבים RRID:SCR_013731 (חור ביער, MA) שבו נערך חלק של עבודה זו. אנו מודים גם תוכנית סרקא / Generalitat דה קטלוניה לתמיכה מוסדית. א. ל הוא עמית Húnter סרה.
Materials
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
Riferimenti
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
- Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
- Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).
- Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
- Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscienze. 5 (12), 2175-2186 (1980).
- Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
- Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
- Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).
- Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Biologia dello sviluppo. 317 (1), 174-186 (2008).
- Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Biologia dello sviluppo. 426 (2), 325-335 (2017).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
- Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14 (2016).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
- McDiarmid, R., Altig, R. . Tadpoles: The biology of anuran larvae. , 149-169 (1999).
- Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
- Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
- Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).
