Girini di Xenopus offrono una piattaforma unica per studiare la funzione del sistema nervoso in vivo. Descriviamo le metodologie per valutare l’elaborazione di informazioni olfattive in vita Xenopus larve in normali condizioni di allevamento o dopo la ferita.
Girini di Xenopus offrono una piattaforma unica per studiare la funzione del sistema nervoso. Essi forniscono molteplici vantaggi sperimentali, quali l’accessibilità a numerosi approcci di imaging, tecniche elettrofisiologiche e comportamentali saggi. Il sistema olfattivo di Xenopus girino è particolarmente adatto per studiare la funzione delle sinapsi stabilito durante lo sviluppo normale o riformato dopo la ferita. Qui, descriviamo le metodologie per valutare l’elaborazione delle informazioni olfattive nella vita di larve di Xenopus . Descriviamo una combinazione di misurazioni in vivo delle risposte del calcio presinaptico in glomeruli del bulbo olfattivo con dosaggi comportamento olfattivo-guida. Metodi possono essere combinati con il transection dei nervi olfattivi per studiare il riavvolgimento delle connessioni sinaptiche. Gli esperimenti sono presentati utilizzando animali wild-type e geneticamente modificati che esprimono i reporter GFP in cellule del sistema nervoso centrale. Applicazione degli approcci descritti a girini geneticamente modificati può essere utile per svelare le basi molecolari che definiscono il comportamento dei vertebrati.
Girini di Xenopus costituiscono un eccellente modello animale per studiare la funzione normale del sistema nervoso. Trasparenza, un genoma sequenziato completamente1,2e accessibilità alle tecniche chirurgiche, elettrofisiologiche e imaging sono proprietà uniche delle larve di Xenopus che consentono di indagare funzioni neuronali in vivo3 . Alcune delle possibilità più sperimentale di questo modello animale sono illustrate da studi approfonditi su girino sistemi sensoriali e motori4,5,6. Un circuito neuronale particolarmente adatto per studiare molti aspetti di elaborazione a livello delle sinapsi delle informazioni è il sistema olfattivo girino di Xenopus 7. In primo luogo, la sua connettività sinaptica è ben definita: neuroni olfattivi (ORNs) del progetto al bulbo olfattivo e stabilire contatti sinaptici con dendriti delle cellule mitrali/trapuntato all’interno dei glomeruli per generare mappe di odore. In secondo luogo, sua ORNs vengono continuamente generati da neurogenesi per tutta la vita per mantenere la funzionalità delle vie olfattive8. E in terzo luogo, perché il sistema olfattivo Mostra una grande capacità rigenerativa, girini di Xenopus sono in grado di riformare completamente il loro bulbo olfattivo dopo ablazione9.
In questo articolo, descriviamo gli approcci che combinano formazione immagine dei glomeruli olfattivi in girini vivente con esperimenti comportamentali per studiare la funzionalità delle vie olfattive. I metodi descritti qui sono stati utilizzati per studiare il recupero funzionale di connettività glomerulare nel bulbo olfattivo dopo nervo olfattivo transection10. I dati ottenuti in girini di Xenopus sono rappresentativi dei vertebrati poiché l’elaborazione olfattiva evolutivo conservato.
I metodi descritti sono esemplificati utilizzando X. tropicalis ma può essere facilmente implementati in X. laevis. Nonostante le dimensioni dell’adulto X. laevis, entrambe le specie sono notevolmente simili durante le fasi di girino. Le principali differenze risiedono a livello genomico. X. laevis Visualizza scarsa trattabilità genetico, determinato prevalentemente dalla sua allotetraploide genoma e tempo di lunga generazione (circa 1 anno). Al contrario, x. tropicalis è più suscettibili di modificazioni genetiche, grazie alla sua più breve tempo di generazione (5 – 8 mesi) e il genoma diploide. Gli esperimenti rappresentativi sono illustrati per animali di selvaggio-tipo e tre diverse linee transgeniche: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) e tubb2:GFP (X. laevis).
Le metodologie descritte nel lavoro attuale dovrebbero essere considerate a fianco la genetica progredisce nel campo di Xenopus . La semplicità e la facile implementazione di tecniche presentate li rende particolarmente utili per la valutazione già descritto mutanti11, nonché linee di Xenopus generati da CRISPR-Cas9 tecnologia12. Inoltre descriviamo una procedura chirurgica utilizzata per transetto nervi olfattivi che può essere implementati in qualsiasi laboratorio avendo accesso a girini di Xenopus . Gli approcci utilizzati per la valutazione delle risposte del calcio presinaptico e olfattivo-Guida di comportamento richiedono attrezzature specifiche, seppur disponibile ad un costo moderato. Metodologie sono presentati in una forma semplice per promuovere il loro uso in gruppi di ricerca e potrebbero porre le basi di analisi più complesse sia implementando miglioramenti o l’associazione ad altre tecniche, ossia approcci di genetica o istologici, .
Questo documento vengono descritte le tecniche che sono utili per analizzare la funzionalità delle vie olfattive in vita girini di Xenopus . Il protocollo attuale è particolarmente utile per i laboratori che lavorano, o hanno accesso a Xenopus; Tuttavia, è anche interessante per quei ricercatori che studiano le basi cellulari e molecolari di riparazione e rigenerazione neuronale. Risultati ottenuti in Xenopus possono essere combinati con dati raccolti in altri modelli vertebrati per identifi…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofinanziato dal Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR), di premi di ricerca competitivo dalla M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship Fund, Laura e Arthur Colwin dotato estate Research Fellowship Fund , la compagnia di Fischbach e il grande fondo di generazione il Marine Biological Laboratory e la nazionale RRID:SCR_013731 di risorsa di Xenopus (Woods Hole, MA) dove una parte di questo lavoro è stato condotto. Ringraziamo anche il programma CERCA / Generalitat de Catalunya per sostegno istituzionale. A.L. è un collega di Serra Húnter.
Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
Epoxy resin | RS Components | ||
Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |