Funksjonell evaluering av Olfactory stier i levende Xenopus rumpetroll
Summary
Xenopus rumpetroll tilbyr en unik plattform for å undersøke funksjon av det nervøse systemet i vivo. Vi beskriver metoder for å vurdere behandling av olfactory informasjon i levende Xenopus Larvene normale oppdrett forhold eller skade.
Abstract
Xenopus rumpetroll tilbyr en unik plattform for å undersøke funksjon av nervesystemet. De gir flere eksperimentelle fordeler, for eksempel tilgjengelighet til mange tenkelig tilnærminger, elektrofysiologiske teknikker og atferdsmessige analyser. Xenopus rumpetroll olfactory systemet er spesielt godt egnet til undersøke funksjonen i synapser etablert under normal utvikling eller reformert etter skader. Her beskriver vi metoder for å vurdere behandling av olfactory informasjon i levende Xenopus larver. Vi skissere en kombinasjon av i vivo målinger av presynaptic kalsium svar i glomeruli av olfactory pære med olfactory-guidede atferd analyser. Metoder kan kombineres med transection av olfactory nerver å studere rewiring av synaptic. Eksperimenter presenteres bruke både vill-type og genmodifiserte dyr uttrykke GFP journalister i sentralnervesystemet celler. Anvendelse av tilnærminger beskrevet å genmodifiserte rumpetroll kan være nyttig for unraveling molekylær baser som definerer virveldyr atferd.
Introduction
Xenopus rumpetroll utgjør en utmerket dyr modell for å studere normal funksjon av nervesystemet. Åpenhet, fullt sekvensert genomet1,2og tilgjengelighet til kirurgisk, elektrofysiologiske og imaging teknikker er unike egenskaper av Xenopus Larvene at undersøke neuronal funksjoner i vivo3 . Noen av flere eksperimentelle mulighetene av denne dyr modellen er illustrert av de grundige studiene utført i rumpetroll sensorisk og motor4,5,6. En spesielt velegnet neuronal krets å studere mange aspekter av informasjonsbehandling på nivå med synapser er Xenopus rumpetroll olfactory system7. For det første, dens synaptic connectivity er godt definert: olfactory reseptor neurons (ORNs) prosjektet til olfactory pære og synaptic kontakter med dendrites av mitral/tuftede celler i glomeruli å generere lukt kart. For det andre, sin ORNs er kontinuerlig generert av neurogenesis hele livet å opprettholde funksjonen av olfactory trasé8. For det tredje, fordi olfactory systemet viser en stor regenerativ evne, Xenopus rumpetroll er kjøpedyktig helt reformere sine Luktelappen etter ablasjon9.
I dette papir beskriver vi innfallsvinkler som kombinerer avbilding av olfactory glomeruli i levende rumpetroll med atferdsmessige eksperimenter å studere funksjonaliteten av olfactory. Metodene finnesher ble brukt til å studere den funksjonelle utvinningen av glomerular i olfactory pære etter olfactory nerve transection10. Data innhentet i Xenopus rumpetroll er representant for virveldyr siden olfactory behandling er evolusjonære bevart.
Metodene som er beskrevet er eksemplifisert ved hjelp av X. tropicalis , men de kan lett bli implementert i X. laevis. Til tross for større størrelsen på voksen X. laeviser både arter bemerkelsesverdig lik i rumpetroll fasen. Hovedforskjellen ligger på genomisk nivå. X. laevis viser dårlig genetisk tractability, avhengig av allotetraploid genomet og lang generasjonstid (ca 1 år). Derimot er X. tropicalis mer mottakelig for genetiske modifikasjoner pga kortere generasjonstid (5-8 måneder) og diploide genom. Representant eksperimenter er illustrert vill-type dyr og tre forskjellige transgene linjer: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) og tubb2:GFP (X. laevis).
Metodikkene i arbeidet bør vurderes sammen med de genetiske utvikler i feltet Xenopus . Enkelhet og enkel implementering av teknikkene presentert gjør dem spesielt nyttig for å vurdere allerede beskrevet mutanter11, samt Xenopus linjer genereres av CRISPR-Cas9 teknologi12. Vi beskriver også kirurgisk prosedyre for å mudderbunn olfactory nerver som kan gjennomføres i et laboratorium har tilgang til Xenopus rumpetroll. Tilnærminger brukt for å evaluere presynaptic kalsium svar og olfactory-guidede problemet krever bestemt utstyr, enskjønt anvendelig til en moderat pris. Metoder er presentert i et enkelt skjema for å fremme deres bruk i forskningsgrupper og kan angi grunnlaget for mer kompliserte analyser ved å implementere forbedringer eller foreningen andre teknikker, i.e., histologiske eller genetiske tilnærminger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette dokumentet beskriver teknikker som er nyttig å undersøke funksjonaliteten av olfactory i levende Xenopus rumpetroll. Gjeldende protokollen er spesielt nyttig for de laboratoriene som fungerer, eller har tilgang til Xenopus; men er det også interessant for de forskerne studere cellulære og molekylære baser av neuronal regenerering og reparasjon. Resultatene i Xenopus kan kombineres med data samlet i andre virveldyr modeller å identifisere bevarte mekanismer. Metodene beskrevet nytte …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofunded av den europeiske Regional Development Fund (ERDF), av konkurransedyktig forskning priser fra M. G. F. Fuortes Memorial fellesskap, Stephen W. Kuffler fellesskap fondet, Laura og Arthur Colwin utstyrt sommer Research Fellowship Fund , Fischbach fellesskap og stor generasjon fondet Marine Biological Laboratory og den nasjonale Xenopus ressurs RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) hvor en del av dette arbeidet ble utført. Vi takker også Søk etter Program / Generalitat de Catalunya for institusjonelle støtte. Al er en Serra Húnter.
Materials
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
Riferimenti
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
- Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
- Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).
- Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
- Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscienze. 5 (12), 2175-2186 (1980).
- Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
- Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
- Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).
- Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Biologia dello sviluppo. 317 (1), 174-186 (2008).
- Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Biologia dello sviluppo. 426 (2), 325-335 (2017).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
- Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14 (2016).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
- McDiarmid, R., Altig, R. . Tadpoles: The biology of anuran larvae. , 149-169 (1999).
- Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
- Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
- Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).
