Funktionell utvärdering av lukt vägar i levande Xenopus grodyngel
Summary
Xenopus grodyngel erbjuder en unik plattform för att undersöka funktionen av nervsystemet invivo. Vi beskriver metoder för att utvärdera behandlingen av lukt information i levande Xenopus larver under normala uppfödning eller efter skada.
Abstract
Xenopus grodyngel erbjuder en unik plattform för att undersöka funktionen av nervsystemet. De ger flera experimentella fördelar, såsom tillgänglighet till talrika bildgivande metoder, elektrofysiologiska tekniker och beteendemässiga analyser. Xenopus grodyngel Luktsinnet är särskilt väl lämpad att undersöka funktionen av synapser fastställts under normala utveckling eller reformeras efter skada. Här, vi beskriver metoder för att utvärdera behandlingen av lukt information i levande Xenopus larver. Vi beskriva en kombination av invivo mätningar av presynaptiska calcium svaren i glomeruli i luktbulben med lukt-guidad beteende analyser. Metoder kan kombineras med transection av luktsinnet nerver att studera den uppladdning av synaptic anslutning. Experiment presenteras med både vildtyp och genetiskt modifierade djur uttrycker GFP reportrar i centrala nervsystemet celler. Tillämpningen av de metoder som beskrivs till genetiskt modifierade grodyngel kan vara användbart för att nysta upp de molekylära baser som definierar ryggradsdjur beteende.
Introduction
Xenopus grodyngel utgör en utmärkt djurmodell för att studera nervsystemets normala funktion. Öppenhet, fullt sekvenserat genomet1,2och tillgängligheten till kirurgisk, elektrofysiologiska och imaging tekniker är unika egenskaper av Xenopus larver som tillåter undersöker neuronala funktioner i vivo3 . Några av flera experimentella möjligheterna av denna djurmodell illustreras av de grundliga studier som utförts på tadpole sensoriska och motoriska system4,5,6. En särskilt väl lämpad neuronala krets att studera många aspekter av informationsbehandling på nivån av synapser är Xenopus grodyngel luktsystem7. För det första dess synaptic anslutning är väl definierad: luktreceptor nervceller (ORNs) projektet till luktbulben och upprätta synaptiska kontakter med dendriter av mitral/tuftade celler inom glomeruli att generera lukt kartor. För det andra skapas dess ORNs kontinuerligt av neurogenes i hela livet att behålla funktionaliteten på olfactory vägar8. Och för det tredje eftersom luktsinnet visar en stor regenerativ förmåga, Xenopus grodyngel kan helt reformera deras luktbulben efter ablation9.
I detta papper beskriver vi metoder som kombinerar avbildning av lukt glomeruli i levande grodyngel med beteendemässiga experiment för att studera funktionaliteten på olfactory vägar. De metoder som beskrivs här användes för att studera glomerulär connectivity i luktbulben funktionell återhämtning efter luktnerven transection10. Data som erhållits i Xenopus grodyngel är representativa för ryggradsdjur eftersom lukt behandling är evolutionärt bevarade.
De metoder som beskrivs exemplifieras med X. tropicalis men de kan enkelt implementeras i X. laevis. Trots den största storleken av vuxen X. laevisär båda arter anmärkningsvärt liknande under grodyngel stadier. De viktigaste skillnaderna är bosatta på genomisk nivå. X. laevis visar dålig genetisk tractability, mestadels bestäms av dess allotetraploid genomet och lång tid (cirka 1 år). Däremot är X. tropicalis mer mottagliga för genetiska modifieringar på grund av dess kortare generationstid (5 – 8 månader) och diploida genomet. De representativa experiment illustreras för vilda djur och tre olika transgena linjerna: Hb9:GFP (X. tropicalis), NBT:GFP (X. tropicalis) och tubb2:GFP (X. laevis).
De metoder som beskrivs i det nuvarande arbetet bör övervägas tillsammans med de genetiska fortskrider i fältet Xenopus . Den enkelhet och enkel implementering av tekniker presenteras gör dem särskilt användbara för att utvärdera redan beskrivits mutanter11, liksom Xenopus rader genereras av CRISPR-Cas9-teknik12. Vi beskriver också ett kirurgiskt ingrepp som brukade transekt luktsinnet nerver som kan genomföras i ett laboratorium som har tillgång till Xenopus grodyngel. Metoderna som används för att utvärdera presynaptiska calcium svaren och lukt-guidad beteende kräver särskild utrustning, om än på en måttlig kostnad. Metoder presenteras i en enkel form att främja deras användning i forskargrupper och kan ställa baserna av mer komplexa analyser av genomföra förbättringar eller av föreningen till andra tekniker, dvs, histologiska eller genetiska metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta dokument beskriver tekniker som är användbara för att undersöka funktionen av lukt vägar i levande Xenopus grodyngel. Det nuvarande protokollet är särskilt användbart för de laboratorier som arbetar, eller har tillgång till Xenopus; men är det också intressant för de forskare som studerar cellulära och molekylära baserna av neuronala förnyelse och reparation. Resultat som erhållits i Xenopus kan kombineras med uppgifter som samlats in i andra ryggradsdjur modeller för at…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av bidrag från El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) samfinansieras av den Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF), av konkurrenskraftig forskning awards från den M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Fellowship fonden, Laura och Arthur Colwin begåvad sommaren Research Fellowship Fund , den Fischbach gemenskap och stor Generation fonden av den marinbiologiska laboratorium och den nationella Xenopus resurs RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) där en del av detta arbete utfördes. Vi tackar också CERCA Program / Generalitat de Catalunya för institutionellt stöd. A.L. är en Serra Húnter Karl.
Materials
| Salts for aquariums (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Tweezers #5 (tip 0.025 x 0.005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Scissors (tip 0.015 x 0.015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calcium Green dextran, Potassium Salt, 10,000 MW, Anionic | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilicate capillaries for microinjection | Sutter Instrument | B100-75-10 | O.D.=1.0 mm., I.D.=0.75 mm. |
| Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Microinjector | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil micropipettes | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Upright microscope | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD Camera | Hamamatsu | Image EM | |
| Solenoid valves | Warner Instruments | VC-6 Six Channel system | |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD Camera | Zeiss | MRC-5 Camera | Controlled by Zen software |
| camera lens | Thorlabs | MVL8ML3 | There are multiple possibilities that should be adapted to the camera model used |
| Epoxy resin | RS Components | ||
| Manifold | Warner Instruments | MP-6 perfusion manifold | |
| Micromanipulator for local delivery of solutions | Narishige | MN-153 | |
| Mini magnetic clamps | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylene tubing | Warner Instruments | 64-0755 | O.D.=1.57 mm., I.D.=1.14 mm. |
Riferimenti
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Li, J., Erisir, A., Cline, H. In vivo time-lapse imaging and serial section electron microscopy reveal developmental synaptic rearrangements. Neuron. 69 (2), 273-286 (2011).
- Dietrich, H., Glasauer, S., Straka, H. Functional Organization of Vestibulo-Ocular Responses in Abducens Motoneurons. Journal of Neuroscience. 37 (15), 4032-4045 (2017).
- Buhl, E., Roberts, A., Soffe, S. R. The role of a trigeminal sensory nucleus in the initiation of locomotion. Journal of Physiology. 590, 2453-2469 (2012).
- Junek, S., Kludt, E., Wolf, F., Schild, D. Olfactory coding with patterns of response latencies. Neuron. 67 (5), 872-884 (2010).
- Stout, R. P., Graziadei, P. P. Influence of the olfactory placode on the development of the brain in Xenopus laevis (Daudin). I. Axonal growth and connections of the transplanted olfactory placode. Neuroscienze. 5 (12), 2175-2186 (1980).
- Yoshino, J., Tochinai, S. Functional regeneration of the olfactory bulb requires reconnection to the olfactory nerve in Xenopus larvae. Development, Growth & Differentiation. 48 (1), 15-24 (2006).
- Terni, B., Pacciolla, P., Masanas, H., Gorostiza, P., Llobet, A. Tight temporal coupling between synaptic rewiring of olfactory glomeruli and the emergence of odor-guided behavior in Xenopus tadpoles. Journal of Comparative Neurology. 525 (17), 3769-3783 (2017).
- Goda, T., et al. Genetic screens for mutations affecting development of Xenopus tropicalis. PLOS Genetics. 2 (6), 91 (2006).
- Nakayama, T., et al. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Jafkins, A., Abu-Daya, A., Noble, A., Zimmerman, L. B., Guille, M. Husbandry of Xenopus tropicalis. Methods in Molecular Biology. 917, 17-31 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory manual. , (2000).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1956).
- Xu, H., Dude, C. M., Baker, C. V. Fine-grained fate maps for the ophthalmic and maxillomandibular trigeminal placodes in the chick embryo. Biologia dello sviluppo. 317 (1), 174-186 (2008).
- Friedrich, R. W., Korsching, S. I. Combinatorial and chemotopic odorant coding in the zebrafish olfactory bulb visualized by optical imaging. Neuron. 18 (5), 737-752 (1997).
- Ishibashi, S., Cliffe, R., Amaya, E. Highly efficient bi-allelic mutation rates using TALENs in Xenopus tropicalis. Biology Open. 1 (12), 1273-1276 (2012).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journalof Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Koide, T., et al. Olfactory neural circuitry for attraction to amino acids revealed by transposon-mediated gene trap approach in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (24), 9884-9889 (2009).
- Love, N. R., et al. pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource. Development. 138 (24), 5451-5458 (2011).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Biologia dello sviluppo. 426 (2), 325-335 (2017).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1057-1065 (2013).
- Truszkowski, T. L., et al. Fragile X mental retardation protein knockdown in the developing Xenopus tadpole optic tectum results in enhanced feedforward inhibition and behavioral deficits. Neural Development. 11 (1), 14 (2016).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. Journal of Neuroscience. 33 (44), 17247-17252 (2013).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
- Sild, M., Van Horn, M. R., Schohl, A., Jia, D., Ruthazer, E. S. Neural Activity-Dependent Regulation of Radial Glial Filopodial Motility Is Mediated by Glial cGMP-Dependent Protein Kinase 1 and Contributes to Synapse Maturation in the Developing Visual System. Journal of Neuroscience. 36 (19), 5279-5288 (2016).
- McDiarmid, R., Altig, R. . Tadpoles: The biology of anuran larvae. , 149-169 (1999).
- Heerema, J. L., et al. Behavioral and molecular analyses of olfaction-mediated avoidance responses of Rana (Lithobates) catesbeiana tadpoles: Sensitivity to thyroid hormones, estrogen, and treated municipal wastewater effluent. Hormones and Behavior. 101, 85-93 (2018).
- Gaudin, A., Gascuel, J. 3D atlas describing the ontogenic evolution of the primary olfactory projections in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Journal of Comparative Neurology. 489 (4), 403-424 (2005).
- Scheidweiler, U., Nezlin, L., Rabba, J., Müller, B., Schild, D. Slice culture of the olfactory bulb of Xenopus laevis tadpoles. Chemical Senses. 26 (4), 399-407 (2001).
- Manzini, I., Schild, D. Classes and narrowing selectivity of olfactory receptor neurons of Xenopus laevis tadpoles. Journal of General Physiology. 123 (2), 99-107 (2004).
- Kludt, E., Okom, C., Brinkmann, A., Schild, D. Integrating temperature with odor processing in the olfactory bulb. Journal of Neuroscience. 35 (20), 7892-7902 (2015).
