Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas
Summary
En este protocolo, nuestro objetivo es describir un método reproducible para combinar disociado humanas pluripotentes células madre derivadas neuronas y astrocitos juntos en 3D esfera cocultures, mantener estas esferas en condiciones flotantes libres y posteriormente medición de la actividad de circuito sináptico de las esferas con inmunoanálisis y matriz micropozo-microcanal grabaciones.
Abstract
Una barrera para nuestra comprensión de cómo varios tipos de células y señales contribuyen a la función sináptica del circuito es la falta de modelos relevantes para el estudio del cerebro humano. Una tecnología emergente para abordar este tema es el uso de tres dimensiones (3D) nervios cultivos de células, denominado ‘organoides’ o esferoides, para la preservación a largo plazo de las interacciones intercelulares como moléculas de adhesión extracelular. Sin embargo, estos sistemas de cultivo son mucho tiempo y no sistemáticamente generado. Aquí detallamos un método rápidamente y consistentemente producir cocultures 3D de neuronas y astrocitos de humanas pluripotentes células madre. Astrocitos en primer lugar, el distinguido y trasplante de precursores neuronales es disociados y contado. A continuación, las células se combinan en forma de esfera platos con un inhibidor de la Rho-quinasa y en proporciones específicas para producir esferas de tamaño reproducible. Después de varias semanas de la cultura como esferas flotantes, cocultures (‘asteroides’) finalmente se secciona para la inmunotinción o plateados sobre matrices micropozo-microcanal para medir la fuerza y la densidad sináptica. En general, se espera que este protocolo dará 3D esferas neurales que mostrar marcadores del tipo de célula madura restringido, forman sinapsis funcionales y exhiben red sináptica espontánea explosión actividad. Juntos, este sistema permite detección de drogas y las investigaciones sobre los mecanismos de la enfermedad en un modelo más conveniente en comparación con cultivos de monocapa.
Introduction
Los astrocitos son un tipo de célula glial muy abundante dentro de sistema nervioso central (SNC) con una variedad de responsabilidades funcionales más allá de la ayuda estructural. A través de la secreción de factores solubles sinaptogénica y componentes de la matriz extracelular (ECM), astrocitos ayudan en el establecimiento y agrupación de sinapsis Maduritas durante desarrollo1. También juegan un papel crítico en el mantenimiento de la salud y plasticidad de las sinapsis a través de señalización extracelular2,3,4,5y contribuir a la estabilidad a largo plazo de homeostático ambientes mediante la regulación de potasio extracelular y glutamato, así como la secreción de sustratos de energía y ATP6,7,8. Finalmente, puede contribuir a la neurotransmisión por influir en las corrientes extrasinápticos9e indirectamente puede influir en la actividad a través de otros tipos celulares como la promoción de myelination10. Importante, debido a anomalía o disfunción de los astrocitos puede conducir a muchos síndromes del desarrollo neurológico y neuropatología adulto, es evidente la necesidad de incluir astrocitos junto a las neuronas en redes neuronales Ingeniería en orden para un mejor modelo del ambiente endógeno del cerebro. Una característica integral de astrocitos es su capacidad de interacciones dinámicas forma sinapsis neuronal1,11,12. En la ausencia de glia, las neuronas forman un número limitado de las sinapsis, que en general carecen de madurez funcional13.
Los astrocitos humanos Mostrar características morfológicas, transcripcionales y funcionales — tales como aumento en el tamaño y la complejidad de la ramificación, así como sobre los genes — que no son recapitulados en roedores12,14, 15. Como resultado, los estudios utilizando la célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-células neuronales derivadas han aceptado ampliamente como un medio de examinar enfermedades relacionadas con el CNS en vitro en el desarrollo de nuevas terapias, lesiones modelos y paradigmas de la cultura16 ,17. Además, hPSCs permiten el estudio de la formación de la sinapsis humana y función sin necesidad de tejido primario18,19.
Una barrera para nuestra comprensión de cómo varios tipos de células y señales contribuyen a la función sináptica del circuito es la falta de modelos relevantes del cerebro humano. Hay una necesidad de una plataforma adecuada recapitular sus redes sinápticas con alta fidelidad y reproducibilidad. Recientemente, ha surgido interés en la producción de sistemas de cultivo 3D (ampliamente conocido como ‘organoides,’ ‘esferoides’, o ‘mini cerebros’)20 de modelo complejo tridimensional (3D) las estructuras a nivel celular y macro. Sistemas de cultivo 3D mantienen interacciones célula-célula y ECM que son normalmente ausente o limitada en cocultivo 2D típico paradigmas21,22. Existen una gran cantidad de técnicas para el cultivo de esferoides nervios 3D23,24,25; sin embargo, muchos requieren períodos de cultivo prolongado (meses a años) de desarrollo espontáneo y preservación de la capa, con el usuario exhibiendo muy poco control sobre la salida.
Aquí, nos ilustran un método sistemático para rápidamente y constantemente bioingeniero interacciones neuronales entre múltiples tipos de células (previamente diferenciadas neuronas y astrocitos) derivan de hPSCs por Unión de células en cocultures de la esfera (asteroides)26 que recapitulan las complejidades morfológicas específicas de humanos en 3D. Este sistema neuronal alta densidad genera subtipos neuronales dispersos uniformemente que tomar propiedades madura con el tiempo y pueden ser proyectados o analizados de un modo de alto rendimiento. Demostramos por primera vez que los astrocitos humanos inducen la actividad de explosión sináptica red en estos cocultures 3D. Además, este protocolo es fácilmente adaptable para generar esferas de diferentes tamaños, para utilizar células especificadas para diferentes identidades regionales de la CNS y estudiar las interacciones de varios otros tipos celulares como se desee.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se describe un método sistemático para la producción de esferas 3D de nervios cocultures. Las esferas están compuestos por astrocitos y neuronas, que se derivan independientemente de hPSCs. Aunque no es el objetivo de este protocolo, la generación de poblaciones puras de astrocitos del hPSCs28 es un paso crítico y puede ser técnicamente difícil si se realiza sin experiencia previa. Este primer paso en la generación de estos microcircuitos sinápticas debe realizarse con…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Dr. Erik Ullian (UCSF) por entrada intelectual sobre el diseño de estos procedimientos, el Dr. Michael Ward (NIH) para asesoramiento técnico en la diferenciación iNeuron y Barlas de Saba para el análisis preliminar de la imagen.
Materials
| 6 well plate | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 15 ml conical tubes | Olympus Plastics | 28-101 | |
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | Detachment solution |
| AggreWell plate | Stemcell Technologies | 34850 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | 7010 | Prevent cell adhesion to microwell plates |
| Anti/anti | Thermofisher | 15240062 | |
| B27 | Thermofisher | 17504044 | Media Supplement |
| BrainPhys neuronal medium | Stemcell Technologies | 5790 | Neurophysiological basal medium alternative |
| Circular glass coverslips | Neuvitro | GG-12-oz | |
| Cryostor CS10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cryopreservation medium with 10% DMSO |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 10565-042 | With GlutaMAX supplement |
| DMH-1 | Stemcell Technologies | 73634 | HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM |
| Donkey serum | Lampire Biological Laboratories | 7332100 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Doxycycline Hydrochloride (Dox) | Sigma | D3072-1ml | HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF) | Peprotech | 100-18B | Working concentration: 10 ng/mL |
| Fluoromount-G mounting solution | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisherbrand | 22-037-246 | |
| Goat serum | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer |
| Hemacytometer or automatic cell counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Heparin | Sigma | H3149-50KU | Working concentration: 2 mg/mL |
| Magnetic plate | DLAB | 8030170200 | |
| Matrigel membrane matrix | Corning | 354230 | ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled. |
| MEA 2100 System | Multichannel Systems | MEA2100 | |
| Mounting solution | |||
| N2 | Thermofisher | 17502048 | Media Supplement |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | Tissue embedding solution for cryosectioning |
| Pap Pen (Aqua Hold) | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Acros Organics | 169650025 | HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Stemcell Technologies | CA008-300 | |
| Poly-l-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Working concentration: 0.5 mg/mL |
| Rectangular glass cover slips | Fisherfinest Premium Superslip | 12-545-88 | |
| ReLeSR | Stemcell Technologies | 5872 | Detachment and passaging reagent |
| Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) | Tocris | 1254 | Working concentration: 10 uM |
| SB431542 | Stemcell Technologies | 72234 | Working concentration: 2 uM |
| Spinner flasks | Fisher Scientific | 4500-125 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-3 | Working concentration: 20% or 30% in PBS |
| T25 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-207 | Vented caps |
| T75 Culture Flask | Olympus Plastics | 25-209 | Vented caps |
| Terg-A-zyme | Sigma | Z273287-1EA | Detergent. Working concentration: 1% |
| TeSR-E8 basal medium | Stemcell Technologies | 5940 | Human pluripotent stem cell (hPSC) medium |
| TeSR-E8 supplements | Stemcell Technologies | 5940 | Supplements for human pluripotent stem cell medium |
| TritonX-100 | Sigma | X100-500ML | Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer |
| Trypan blue | Invitrogen | T10282 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor 488 | Thermofisher | A-11029 | Secondary antibody |
| AlexaFluor 594 | Thermofisher | A-11037 | Secondary antibody |
| Ezrin | Thermofisher | MA5-13862 | Primary antibody; astrocytes perisynaptic |
| GFAP | Chemicon | MAB360 | Primary antibody; astrocytes |
| GFP | Aves | GFP-1020 | Primary antibody; astrocytes |
| Glt1 | Gift from Dr. Jeffrey Rothstein | n/a | Primary antibody; astrocytes |
| Homer | Synaptic Systems | 160 011 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| MAP2 | Synaptic Systems | 188 004 | Primary antibody; neurons |
| PSD95 | Abcam | ab2723 | Primary antibody; neurons, post-synaptic |
| S100 | Abcam | ab868 | Primary antibody; astrocytes |
| Synapsin 1 | Synaptic Systems | 106 103 | Primary antibody; neurons, pre-synaptic |
| TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) | Covance | MMS-435P | Primary antibody; neurons |
Riferimenti
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