JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia dello sviluppo

Synaptische Microcircuit Modeling met 3D Cocultures van astrocyten en neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

Published: August 16, 2018
doi:
10.3791/58034
, ,
1Center for Neuroregeneration, Department of Neurosurgery,Houston Methodist Research Institute

Summary

In dit protocol, wij streven ernaar om te beschrijven een reproduceerbare methode voor combineren losgekoppeld menselijke pluripotente stamcel afgeleid neuronen en astrocyten samen in 3D bol cocultures, behoud van deze gebieden vrij zwevende voorwaarden, en daarna het meten van synaptic circuit activiteit van de bollen met immunoanalysis en multielectrode serie opnamen.

Abstract

Een belemmering voor ons begrip van hoe verschillende celtypes en signalen aan synaptic circuit functie bijdragen is het ontbreken van relevante modellen voor het bestuderen van het menselijk brein. Een opkomende technologie om dit probleem te verhelpen is het gebruik van drie dimensionale (3D) neurale celculturen, betiteld als ‘organoids’ of ‘spheroïden’, voor de langetermijnbewaring van intercellulaire interacties met inbegrip van extracellulaire celadhesie-moleculen. Echter, deze cultuur-systemen zijn tijdrovend en niet systematisch gegenereerde. Hier, we detail een methode om snel en consistent produceren 3D cocultures van neuronen en astrocyten van menselijke pluripotente stamcellen. Eerste, vooraf gedifferentieerde astrocyten zijn neuronale voorlopercellen losgekoppeld en geteld. Vervolgens cellen worden gecombineerd in de bol-vormende gerechten met een Rho-Kinase inhibitor en op specifieke verhoudingen tot bollen van reproduceerbare grootte. Na verscheidene weken van cultuur als drijvende bollen, zijn cocultures (‘Asteroïden’) ten slotte gesegmenteerd voor immunokleuring of verguld op multielectrode arrays synaptic dichtheid en de sterkte te meten. In het algemeen verwacht wordt dat dit protocol 3D neurale bollen die volwassen cel-type beperkt markeringen weergeven, functionele synapsen vormen en spontane synaptic netwerkactiviteit barsten vertonen zal opleveren. Samen, toelaat dit systeem drug screening en onderzoek naar mechanismen van ziekte in een geschikter model ten opzichte van enkelgelaagde culturen.

Introduction

Astrocyten zijn een zeer overvloedige gliale celtype binnen het centrale zenuwstelsel (CNS) met een scala aan functionele verantwoordelijkheden buiten structurele steun. Door middel van de secretie van oplosbare synaptogenic factoren en componenten van de extracellulaire matrix (ECM), astrocyten steun bij de oprichting en clustering van volwassen synapsen tijdens ontwikkeling1. Ze ook spelen een cruciale rol in het behoud van de gezondheid en de plasticiteit van synapsen t/m extracellulaire signalering2,3,4,5, en bijdragen aan de stabiliteit op lange termijn van homeostatische omgevingen door het reguleren van extracellulaire kalium en glutamaat, evenals de secretie van energie substraten en ATP6,7,8. Ten slotte, ze kunnen bijdragen tot de transmissie door het beïnvloeden van extrasynaptic stromingen9, en niet indirect invloed kunnen uitoefenen op de activiteit via andere celtypes zoals het bevorderen van myelinisering10. Belangrijker, omdat abnormaliteit of disfunctie van astrocyten tot veel neurologische syndromen en volwassen Neuropathologie leiden kan, is er een duidelijke behoefte aan het opnemen van astrocyten naast neuronen binnen gemanipuleerde neurale netwerken in volgorde voor een betere model van het endogene hersenen milieu. Een wezenlijk kenmerk van astrocyten is hun vermogen om de dynamische interacties vorm met neuronale synapsen1,11,12. Bij het ontbreken van glia vormen de neuronen een beperkt aantal synapsen, die in het algemeen ook functionele looptijd13 ontbreekt.

Menselijke astrocyten morfologische, transcriptionele en functionele kenmerken vertonen die — zoals toegenomen omvang en complexiteit van vertakkende, evenals soortspecifieke genen-dat zijn niet gerecapituleerd in knaagdieren12,14, 15. Dientengevolge, studies met behulp van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide neurale cellen hebben worden geaccepteerd als een middel van CNS-gerelateerde ziekten in vitro onderzoeken terwijl het ontwikkelen van nieuwe therapieën, letsel modellen en cultuur paradigma’s16 ,17. Bovendien toestaan hPSCs de studie van menselijke synapse formatie en functioneren zonder de behoefte aan primaire weefsel18,19.

Een belemmering voor ons begrip van hoe verschillende celtypes en signalen aan synaptic circuit functie bijdragen is het ontbreken van relevante modellen van de menselijke hersenen. Er is behoefte aan een geschikt platform om te recapituleren zijn synaptic netwerken met hifi en reproduceerbaarheid. Onlangs, belang is gebleken bij de productie van 3D cultuur systemen (algemeen bekend als ‘organoids,’ ‘spheroïden’, of ‘mini hersenen’)20 tot complexe driedimensionale (3D) model structuren op mobiele en macro niveau. 3D cultuur systemen behouden ECM en cel-cel interacties die normaal afwezig of beperkt tijdens typische 2D coculture paradigma’s21,22. Een overvloed aan technieken bestaan voor het kweken van 3D neurale spheroïden23,24,25; echter veel vereisen lange cultuur perioden (maanden tot jaren) voor spontane ontwikkeling en behoud van de laag, met de gebruiker vertonen zeer weinig controle over de output.

Hier, we illustreren een systematische methode om snel en consequent bioengineer Neurale interacties tussen meerdere celtypen (vooraf gedifferentieerde neuronen en astrocyten) afgeleid van hPSCs door het monteren van cellen in het gebied cocultures (‘Asteroïden’)26 die recapituleren mens-specifieke morfologische complexiteit van 3D. Gelijkmatig verspreide neurale subtypen dat volwassen eigenschappen overneemt na verloop van tijd en kunnen worden vertoond of vehiculumcontrolegroep in een high-throughput manier genereert deze high-density neurale systeem. We laten zien voor de eerste keer dat menselijke astrocyten synaptic netwerkactiviteit burst in deze 3D cocultures induceren. Dit protocol is bovendien gemakkelijk aan te passen voor het genereren van bollen van verschillende maten, te gebruiken van cellen die zijn opgegeven met verschillende regionale identiteiten van de CNS, en te bestuderen van interacties van meerdere andere celtypes zoals gewenst.

Protocol

1. cel cultuur en bereiding van het reagens Opmerking: De protocollen in deze sectie zijn geschreven in de volgorde waarin ze worden weergegeven in het differentiatie-protocol (sectie 2). Zie de Tabel van materialen voor materialen en catalogus nummers. Gecoate platen voorbereiden celkweek. Verdun extracellulaire matrix (ECM) coating oplossing met DMEM/F12 media te bereiden een 1 mg/mL stockoplossing. Aliquot de verdunde ECM in 30 conische…

Representative Results

Wanneer goed uitgevoerd, zal dit protocol omschreven populaties van functionele cocultures van astrocyten28,33,34 en neuronen35 gegenereerd op basis van hPSCs (figuur 1A-1C), produceren als gedetailleerde eerder26 en hier beschreven in stap 2.1-2.2. Deze stapsgewijze procedure, met het gebruik van micro…

Discussion

In dit protocol beschrijven we een systematische methode voor de productie van 3D bollen van neurale cocultures. De bollen zijn samengesteld uit astrocyten en neuronen, die onafhankelijk zijn afgeleid van hPSCs. Hoewel nog niet de focus van dit protocol, kan de generatie van pure populaties van astrocyten van hPSCs28 is een cruciale stap en technisch uitdagende indien dat gebeurt zonder voorafgaande ervaring. Deze eerste stap in de generatie van deze synaptic micro schakelingen moet worden uitgevo…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zouden graag bedanken Dr. Erik Ullian (UCSF) voor intellectuele input over het ontwerp van deze procedures, Dr. Michael Ward (NIH) voor technisch advies over iNeuron differentiatie, en Saba Barlas voor voorlopige beeldanalyse.

Materials

6 well plate Fisher Scientific 08-772-1B
15 ml conical tubes Olympus Plastics 28-101
Accutase Sigma A6964-100ML Detachment solution
AggreWell plate Stemcell Technologies 34850
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies 7010 Prevent cell adhesion to microwell plates
Anti/anti Thermofisher 15240062
B27 Thermofisher 17504044 Media Supplement
BrainPhys neuronal medium Stemcell Technologies 5790 Neurophysiological basal medium alternative
Circular glass coverslips Neuvitro GG-12-oz
Cryostor CS10 Stemcell Technologies 7930 Cryopreservation medium with 10% DMSO
DMEM/F12 Thermofisher 10565-042 With GlutaMAX supplement
DMH-1 Stemcell Technologies 73634 HAZARD: Toxic if swallowed. Working concentration: 2 uM
Donkey serum Lampire Biological Laboratories 7332100 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Doxycycline Hydrochloride (Dox) Sigma D3072-1ml HAZARD: Toxic for pregnant women. Working concentration: 2 ug/mL
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Working concentration: 10 ng/mL
Fibroblast growth factor-2 (FGF) Peprotech 100-18B Working concentration: 10 ng/mL
Fluoromount-G mounting solution Southern Biotech 0100-01
Glass slides Fisherbrand 22-037-246
Goat serum Lampire Biological Laboratories 7332500 Working concentration: 5% in primary blocking buffer, 1% in secondary blocking buffer
Hemacytometer or automatic cell counter Life Technologies AMQAX1000
Heparin Sigma H3149-50KU Working concentration: 2 mg/mL
Magnetic plate DLAB 8030170200
Matrigel membrane matrix Corning 354230 ECM coating solution. Working concentration: 80 ug/ml. Prepare on ice and ensure that pipettes, tubes, and media are pre-chilled.
MEA 2100 System Multichannel Systems MEA2100
Mounting solution
N2 Thermofisher 17502048 Media Supplement
OCT Tissue-Tek 4583 Tissue embedding solution for cryosectioning
Pap Pen (Aqua Hold) Scientific Device Laboratory 9804-02
Paraformaldehyde (PFA) Acros Organics 169650025 HAZARD: Toxic if inhaled. Working concentration: 4% in PBS
Phosphate buffered saline (PBS) Stemcell Technologies CA008-300
Poly-l-ornithine (PLO) Sigma P3655-100MG Working concentration: 0.5 mg/mL
Rectangular glass cover slips Fisherfinest Premium Superslip 12-545-88
ReLeSR Stemcell Technologies 5872 Detachment and passaging reagent
Rho-Kinase Inhibitor Y27632- (Y) Tocris 1254 Working concentration: 10 uM
SB431542 Stemcell Technologies 72234 Working concentration: 2 uM
Spinner flasks Fisher Scientific 4500-125
Sucrose Fisher Chemical S5-3 Working concentration: 20% or 30% in PBS
T25 Culture Flask Olympus Plastics 25-207 Vented caps
T75 Culture Flask Olympus Plastics 25-209 Vented caps
Terg-A-zyme Sigma Z273287-1EA Detergent. Working concentration: 1%
TeSR-E8 basal medium Stemcell Technologies 5940 Human pluripotent stem cell (hPSC) medium
TeSR-E8 supplements Stemcell Technologies 5940 Supplements for human pluripotent stem cell medium
TritonX-100 Sigma X100-500ML Detergent for cell permeabilization. Working concentration: 0.25% in blocking buffer
Trypan blue Invitrogen T10282
Antibodies
AlexaFluor 488 Thermofisher A-11029 Secondary antibody
AlexaFluor 594 Thermofisher A-11037 Secondary antibody
Ezrin Thermofisher MA5-13862 Primary antibody; astrocytes perisynaptic
GFAP Chemicon MAB360 Primary antibody; astrocytes
GFP Aves GFP-1020 Primary antibody; astrocytes
Glt1 Gift from Dr. Jeffrey Rothstein n/a Primary antibody; astrocytes
Homer Synaptic Systems 160 011 Primary antibody; neurons, post-synaptic
MAP2 Synaptic Systems 188 004 Primary antibody; neurons
PSD95 Abcam ab2723 Primary antibody; neurons, post-synaptic
S100 Abcam ab868 Primary antibody; astrocytes
Synapsin 1 Synaptic Systems 106 103 Primary antibody; neurons, pre-synaptic
TuJ1/β3-tubulin (TUBB3) Covance MMS-435P Primary antibody; neurons
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Ullian, E. M., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Role for Glia in Synaptogenesis. Glia. 47, 209-216 (2004).
  2. Baldwin, K. T., Eroglu, C. Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis. Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).
  3. Molofsky, A. V., et al. Astrocyte-encoded positional cues maintain sensorimotor circuit integrity. Nature. 509 (7499), 189-194 (2014).
  4. Sultan, S., et al. Synaptic Integration of Adult-Born Hippocampal Neurons Is Locally Controlled by Astrocytes. Neuron. 88, 957-972 (2015).
  5. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  6. Cheung, G., Sibille, J., Zapata, J., Rouach, N. Activity-Dependent Plasticity of Astroglial Potassium and Glutamate Clearance. Neural Plasticity. , 109106 (2015).
  7. Ghezali, G., Dallerac, G., Rouach, N. Perisynaptic astroglial processes dynamic processors of neuronal information. Brain Struct Funct. 221, 2427-2442 (2016).
  8. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of Astrocytes and their Potential As Therapeutic Targets. Neurotherapeutics. 7, 338-353 (2010).
  9. Pál, B. Astrocytic Actions on Extrasynaptic Neuronal Currents. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 474 (2015).
  10. Kiray, H., Lindsay, S. L., Hosseinzadeh, S., Barnett, S. C. The multifaceted role of astrocytes in regulating myelination. Experimental Neurology. 283, 541-549 (2016).
  11. Allen, N. J., Eroglu, C. Cell Biology of Astrocyte-Synapse Interactions. Neuron. 96 (3), 697-708 (2017).
  12. Krencik, R., van Asperen, J. V., Ullian, E. M. Human astrocytes are distinct contributors to the complexity of synaptic function. Brain Research Bulletin. 129, 66-73 (2017).
  13. Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of Synapse Number by Glia. Science. 291, 657-662 (2001).
  14. Oberheim Bush, N. A., Nedergaard, M. Do Evolutionary Changes in Astrocytes Contribute to the Computational Power of the Hominid Brain?. Neurochemical Research. 42 (9), 2577-2587 (2017).
  15. Han, X., et al. Forebrain Engraftment by Human Glial Progenitor Cells Enhances Synaptic Plasticity and Learning in Adult Mice. Cell Stem Cell. 12 (3), 342-353 (2013).
  16. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. The EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  17. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
  18. Dodla, M. C., Mumaw, J., Stice, S. L. Role of astrocytes, soluble factors, cells adhesion molecules and neurotrophins in functional synapse formation: implications for human embryonic stem cell derived neurons. Stem Cell Res Ther. , 251-260 (2010).
  19. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 1-10 (2013).
  20. Pasca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  21. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144, 938-941 (2017).
  22. Mason, J. O., Price, D. J. Building Brains in a Dish: Prospects for Growing Cerebral Organoids from Stem Cells. Neuroscienze. 334, 105-118 (2016).
  23. Kelava, I., Lancaster, M. A. Dishing out mini-brains: Current progress and future prospects in brain organoid research. Biologia dello sviluppo. 420 (2), 199-209 (2016).
  24. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  25. Sloan, S. A., et al. Human Astrocyte Maturation Captured in 3D Cerebral Cortical Spheroids Derived from Pluripotent Stem Cells. Neuron. , 779-790 (2017).
  26. Krencik, R., et al. Systematic three-dimensional coculture rapidly recapitulates interactions between human neurons and astrocytes. Stem Cell Reports. 9 (6), 1745-1753 (2017).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Krencik, R., Zhang, S. -. C. Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 6 (11), 1710-1717 (2011).
  29. Du, Z. -. W., et al. Generation and expansion of highly pure motor neuron progenitors from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 6, 6626 (2015).
  30. Neely, M. D., et al. DMH1, a highly selective small molecule BMP inhibitor promotes neurogenesis of hiPSCs: Comparison of PAX6 and SOX1 expression during neural induction. ACS Chemical Neuroscience. 3 (6), 482-491 (2012).
  31. Lippmann, E. S., Estevez-Silva, M. C., Ashton, R. S. Defined Human Pluripotent Stem Cell Culture Enables Highly Efficient Neuroepithelium Derivation Without Small Molecule Inhibitors. Stem Cells. 32, 1032-1042 (2014).
  32. Eggan, K., Kawada, J., Kaneda, S., Kirihara, T., Maroof, A. Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons. Stem Cell Reports. 9, 1441-1449 (2017).
  33. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -. J., Zhang, S. -. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  34. Krencik, R., et al. Dysregulation of astrocyte extracellular signaling in Costello syndrome. Science Translational Medicine. 7 (286), 286 (2015).
  35. Wang, C., et al. Scalable Production of iPSC-Derived Human Neurons to Identify Tau- Lowering Compounds by High-Content Screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  36. Amin, H., Maccione, A., Marinaro, F., Zordan, S., Nieus, T., Berdondini, L. Electrical Responses and Spontaneous Activity of Human iPS-Derived Neuronal Networks Characterized for 3-month Culture with 4096-Electrode Arrays. Frontiers in Neuroscience. 10, (2016).
  37. Kapucu, F. E., Mäkinen, M. E., Tanskanen, J. M. A., Ylä-Outinen, L., Narkilahti, S., Hyttinen, J. A. K. Joint analysis of extracellular spike waveforms and neuronal network bursts. Journal of Neuroscience Methods. 259, 143-155 (2016).
  38. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. Journal of Visualized Experiments. 45, 2-9 (2010).
  39. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  40. Odawara, A., Katoh, H., Matsuda, N., Suzuki, I. Physiological maturation and drug responses of human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks in long-term culture. Scientific reports. 6, 26181 (2016).
  41. Bardy, C., Hurk, , et al. Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro. PNAS. 112 (25), E2725-E2734 (2015).
  42. Monzel, A. S., et al. Derivation of Human Midbrain-Specific Organoids from Neuroepithelial Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1144-1154 (2017).
  43. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  44. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease Modeling in Stem Cell-Derived 3D Organoid Systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2018).
  45. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7647), 373-379 (2013).
  46. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  47. Yan, Y., et al. Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor. Tissue Engineering Part A. , 1-46 (2016).
  48. Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 9 (JAN), 423 (2015).
  49. Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to Culture, Record and Stimulate Neuronal Networks on Micro-electrode Arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), 1-7 (2010).
  50. Shigetomi, E., Patel, S., Khakh, B. S. Probing the Complexities of Astrocyte Calcium Signaling. Trends in Cell Biology. 26 (4), 300-312 (2016).
  51. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Lévi-strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. 14 (7), (2017).

Tags

Synaptic Microcircuit3D CoculturesAstrocytesNeuronsHuman Pluripotent Stem CellsNeural Cell TypesSynaptic Circuit FormationNeuroscienzeOrganoid TechnologiesDrug DevelopmentNeuroregenerationNeural ProgenitorsAstrocyte ProgenitorsAstrocyte SubtypesNeural InductionNeural MediumRho-kinase InhibitorECM-coated PlatesCell AggregationCell DissociationCell Identity ConfirmationCryo-preservation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Cvetkovic, C., Basu, N., Krencik, R. Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (138), e58034, doi:10.3791/58034 (2018).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image