Detta protokoll visar kontrollerbar kärnbildning av kavitation i gel phantoms, genom samtidig exponering för både nära infrarött pulsad laser ljus och hög intensitet fokuserat ultraljud (HIFU). Aktiviteten kavitation kan sedan användas för att förbättra imaging och/eller terapeutiska användningar av HIFU.
I denna studie var plasmoniska Guldnanopartiklar samtidigt utsatt för pulsad nära-infraröd laser ljus och hög intensitet fokuserat ultraljud (HIFU) för kontrollerbar kärnbildning av kavitation i vävnad-härma gel fantomer. In vitro- protokollet utvecklades för att demonstrera genomförbarheten av denna strategi, för både förbättring av imaging och terapeutiska tillämpningar för cancer. Samma utrustning kan användas för både bildhantering och terapeutiska tillämpningar av varierande exponeringens varaktighet av HIFU systemet. För korta exponeringar (10 µs) genererades akustisk bredbandsstrålning genom kontrollerad kärnbildning av tröghetsbaserad kavitation runt Guldnanopartiklar. Dessa utsläpp ger direkta lokalisering av nanopartiklar. För framtida tillämpningar, dessa partiklar kan vara functionalized med molekylär inriktning antikroppar (t.ex. anti-HER2 för bröstcancer) och kan ge exakt lokalisering av cancerogena regioner, komplettera rutinmässig diagnostisk ultraljudsundersökningar. För kontinuerlig våg (CW) exponeringar användes aktiviteten kavitation öka lokaliserad uppvärmning från HIFU exponeringar vilket resulterar i större värmeskador i gel phantoms. De akustiska utsläpp som genereras från tröghetsbaserad kavitation aktivitet under dessa CW exponeringar övervakades med hjälp av en passiv kavitation-detektionssystem (PCD) ge feedback av kavitation aktivitet. Ökad lokaliserad uppvärmning uppnåddes endast genom den unika kombinationen av nanopartiklar, laserljus och HIFU. Ytterligare validering av denna teknik i prekliniska modeller av cancer är nödvändigt.
Hög intensitet fokuserat ultraljud (HIFU), eller fokuserat ultraljud kirurgi (FUS), är en icke-joniserande och icke-invasiv teknik som används för termisk ablation av subkutan vävnad1. Den huvudsakliga användningen av HIFU är vid behandling av mjuk vävnad tumörer2, men det börjar användas för andra applikationer, såsom behandling av ben tumörer3 eller neurologiska villkor4. Det finns två huvudsakliga faktorer som begränsar den utbredda användningen av HIFU i kliniken: för det första, svårigheter i behandling vägledning och för det andra, lång behandling gånger5. Kombinationen av HIFU, pulsad laser belysning och plasmoniska guld nanorör beskrivs av denna metod skulle ge ett sätt att övervinna de nuvarande begränsningarna för HIFU6.
Under HIFU exponeringar är dominerande mekanismen för vävnad ablation termisk skada. Kavitation aktivitet kan dock också spela en roll8. Kavitation aktivitet som sker under HIFU exponeringar kan bestå av både mekaniskt och termiskt medierad kavitation. Mekaniskt medierad kavitation benämns allmänt akustiska kavitation7, vilket är ytterligare subcategorized som bubblor som genomgår antingen icke-inertial eller tröghetsbaserad9 beteende. Termiskt medierad kavitation är från bildandet av gasfickor, genom ex-lösning eller förångning, och är vanligtvis kallas ‘kokande’10. Kavitation aktivitet, mest vanligen tröghetsbaserad kavitation, har visat sig förbättra den termiska värme priser kan uppnås genom HIFU exponeringar11 och därmed hjälpa adress en av dess viktiga begränsningar. Dock av bildandet och aktiviteten av kavitation under HIFU exponeringar kan vara oförutsägbar och leda till negativa effekter såsom över behandlade områden, eller asymmetrisk termisk ablation12. För att kontrollera kavitation aktivitet under HIFU exponeringar, har införandet av externa kärnor undersökts. Dessa kan ta form av mikrobubblor13, fasförskjutning nanoemulsions14 eller plasmoniska nanopartiklar15. Både mikrobubblor och nanoemulsions har visat sig förbättra signal-brus för bildhantering och förbättrad termisk ablationer. Men innebär deras övergående natur de har begränsad funktionalitet över upprepade HIFU exponeringar. Övervakning av kavitation aktivitet under HIFU exponeringar sker med antingen aktiv eller passiv kavitation identifiering (ACD eller PCD, respektive). PCD är en gynnade teknik för detektering av kavitation, som den kan utföras samtidigt med HIFU exponeringar och ger spektrala innehållsinformationen. Spektrala innehållet kan sedan analyseras ytterligare för att identifiera vilken typ av kavitation aktivitet inträffar16. Akustiska bredbandsstrålning används, eftersom dessa utsläpp är unika för förekomsten av tröghetsbaserad kavitation10 och är kopplade till förbättrad HIFU värme11.
Photoacoustic imaging (PAI) är en framväxande kliniska imaging teknik17, som kombinerar den spektrala selektiviteten av pulsad laser excitation med den höga upplösningen av ultraljud imaging18. Det har tidigare använts för att vägleda HIFU exponeringar19, men denna bildteknik begränsas av genomträngningsdjupet av laserljus. Plasmoniska guld nanopartiklar kan användas för att fungera som ‘kontrastmedel’ öka lokala absorptionen av laserljus och därefter amplituden av photoacoustic utsläpp20. För tillräckligt hög laser influenser är det möjligt att orsaka generering av mikroskopiska ånga bubblor som kan användas för mycket lokaliserad imaging21. Men dessa exponeringsnivåer normalt överstiga högsta tillåtna gränsvärdet för användning av laserljuset som i människor22, och således har begränsad användning. Den metod som används i denna studie har tidigare visat att genom att samtidigt exponera de plasmoniska nanopartiklarna till både laser belysning och HIFU, laser fluence och akustiska trycket som behövs för att kärnbildas dessa små ånga bubblor är dramatiskt minskat, och signal-brus-förhållandet för avbildning är ökad23. En metod som beskrivs här för att kombinera plasmoniska nanopartiklar med både laser och HIFU exponeringar för en mycket kontrollerbar teknik för kärnbildning och aktivitet av ånga bubblor.
Detta protokoll är indelad i fyra separata sektioner, som beskriver tillverkningen av vävnad-härma phantom genom att CW exponeringarna i dem att producera termiskt genererade denaturering. Denna denaturering av phantoms simulerar termiskt genererade koagulering nekros upplevs av mjuk vävnad utsätts för HIFU1. I sin tillverkning är det viktigt att se till att förhållandet mellan APS och TEMED är sådan att processen inte katalysera alltför snabbt. När denna process är exoterm, ju snabbare denna kurs, desto högre temperaturen nått25 och således kunde denaturera BSA proteinerna före exponering. Förhållandet mellan APS till TEMED i detta protokoll har ställts in så att detta inte bör ske, men formarna kan placeras i isvatten under de polymeriserande gel att ytterligare minimera denna möjlighet.
Eftersom detta protokoll fokuserar på kärnbildning av kavitation genom att kombinera nanopartiklar, laser illuminations och HIFU exponering, är ett viktigt steg i tillverkningen av gel phantoms att lufta dem under vakuum i minst 30 min. När utsätts för HIFU (särskilt CW exponeringar), även om en termisk lesion inte var närvarande, är det viktigt att rikta ett färskt läge i gel phantoms att undvika redan existerande atomkärnor. När flytta phantom använder datorn kontrollerade översättningssystem är det viktigt att se till att djupet av HIFU fokus (och thus justerad regionen) hålls konsekvent. Detta säkerställer att HIFU trycket och laser fluence nivåerna är enhetlig för varje specifik exponering-parameter. För detta protokoll och efter den inledande placeringen av innehavaren av phantom, är det endast sedan översättas i den lodräta axeln.
De temperaturkänsliga vävnad-härma gelerna används mycket av de HIFU forskning gemenskap25, eftersom de ger en visuell mekanism för övervakning av bildandet av en termisk lesion. Denna studie var det första exemplet på att kombinera dem med nanopartiklar och demonstrera den förstärkning som ges till lesion bildning genom kontrollerad kavitation aktivitet. Även om de klassificeras som vävnad-härma för deras svar på temperatur, finns både deras optiska och akustiska dämpning dock inte. På grund av behovet av att visualisera lesion bildandet i gelerna, är phantoms nära transparent, med en liten gul nyans. Den laser fluence är justerad till konto för detta, betyder det att laserljuset lysande målregionen är kollimerad i stället för diffus som skulle vara för normal vävnad. Därför för att möjliggöra kliniska översättning flera belysning källor skulle behövas för att säkerställa tillräckligt fluence på ytan. För närvarande följer detta arbete de riktlinjer22 för säker användning av lasrar när de utsätts huden. Detta skulle begränsa den maximala laser fluence uppnåbara på djup; Denna teknik skulle således inledningsvis vara lämpade för behandling av ytliga cancerformer som bröstcancer, eller huvud och hals. Plasmoniska nanopartiklar riktade till yta receptorer för dessa typer av cancer kan dessutom ge ökad selektivitet i behandlingar. Men även om detta är ett mycket aktivt forskningsområde, är inga sådana partiklar för närvarande godkända för klinisk användning.
Akustisk dämpning av phantoms med nanopartiklar var mäts för att vara 0.7±0.2 dB/cm6, och, jämfört med värdet för mjuk vävnad på 3-4 dB/cm, det är betydligt lägre. Uppvärmning från HIFU exponeringar i dessa geler skulle därför bli lägre än skulle observeras i mjuk vävnad. Det har visats att tillägg av glaspärlor till gelen ökar dämpning nivåerna liknar mjuk vävnad25. I denna ansökan är detta tillvägagångssätt dock inte möjligt eftersom dessa pärlor skulle agera en kärnbildning källor för kavitation aktivitet även i avsaknad av nanopartiklar, och därmed förvränga tröskeln kavitation. När man jämför värmeeffekten för med resultaten från studien av Choi o.a. (2013) 25, thermal lesioner genererades på peak tryckområden 14-23 MPa (det anges inte om detta var peak positivt eller negativt tryck). Som detta utfördes 1,1 MHz, var dämpning i phantoms lägre än används i denna studie. Metoden nanopartikel-nucleated i denna studie var dock kunna generera termisk lesioner i dessa fantomer vid tryck alltifrån 1.19 till 3.19 MPa, vilket visar att ökad effektivitet över nuvarande metoder.
Framtida tester för denna metod bör ske i en in-vivo -modell att införliva tumör minskning, vävnadsperfusion, molekylär inriktning av nanopartiklar och relevanta akustisk dämpning parametrar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av EPSRC bevilja EP/J021156/1. Författaren vill erkänna stöd från en tidig karriär Leverhulme fellowship (ECF-2013-247).
Single Element HIFU transducer | Sonic Concepts | H-102 | |
55dB Power Amplifier | E&I | A300 | |
Function Generator | Keysight Technologies | 33250A | |
Differential Membrane Hydrophone | Precision Acoustics Ltd | ||
TTL Pulse Generator | Quantum Composers | 9524 | |
Nd:YAG Pulse Laser | Continuum | Surelite I-10 | |
OPO Plus | Continuum | Surelite | |
Fibre Bundle | Thorlabs Inc | BF20LSMA01 | |
Energy Sensor | Thorlabs Inc | ES145C | |
Nanorods | Nanopartz | A12-40-850 | |
Broadband detector | Sonic Concepts | Y-102 | |
5 MHz high pass filter | Allen Avionics | ||
40dB preamplifier | Spectrum GmbH | SPA.1411 | |
14-bit data acquisition card | Spectrum GmbH | M4i.4420×8 | |
Deionised Filtered Water | MilliQ | ||
Acrylamide/Bis-acrylamide solution | Sigma Aldrich | A9927 | |
1 mol/L TRIS Buffer | Sigma Aldrich | T2694 | |
Ammonium Persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
3D printer | CEL-UK | Robox | |
3-axis positioning system | Zolix | ||
Digital Microscope | Dino-lite | AM4113TL | |
Water Tank | Muji | Acrylic Tank | |
Optical Components | Thorlabs Inc | Various | |
Optomechanical Components | Thorlabs Inc | Various | |
BNC Cables | RS | ||
Desktop PC | Custom Made | ||
Hotplate Stirrer | Fisher | ||
SBench6 | Spectrum GmbH | Measurement software |