하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색
Summary
여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.
Abstract
드롭릿 디지털 연쇄 반응 (ddPCR)은 나노 크기의 물에서 기름 개별 반응의 수천에 샘플 분류에 따라 매우 민감한 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 방법. 최근에, ddPCR는 순환 종양 DNA (ctDNA) 검색에 대 한 가장 정확 하 고 중요 한 도구 중 하나가 되고있다. 표준 ddPCR 기술의 주요 한계 중 하나는 각 가능한 유전자 버전을 인식 하는 특정 가수분해 프로브는 필요 반응, 당 상영 될 수 있는 돌연변이의 제한 수입니다. 다른 방법론, 드롭 오프 ddPCR만 한 쌍의 프로브를 감지 하 여 잠재적으로 모든 유전 변경 대상된 지역에서 계량 하므로 처리량을 증가 합니다. 드롭 오프 ddPCR 단일 반응에서 돌연변이의 더 많은 수를 감지의 장점과 함께 기존의 ddPCR 분석 실험에 유사한 감도 표시 합니다. 그것은 비용 효율적인, 귀중 한 시료를 보존 이며 또한 경우 사용할 수 있습니다 검색 도구로 돌연변이 선험적으로알려져 있지 않습니다.
Introduction
암 개발에 관련 된 체세포 돌연변이의 수천 보고 된1되었습니다. 이 중, 몇 가지 예측 마커 타겟된 치료 2,3 의 효능 이며 상영이 돌연변이의 유전은 이제 일상적인 임상 연습. 드롭릿 디지털 PCR (ddPCR) 기술은 높은 검색 정확도로 유무의 변이 대 한 모니터링에 사용할 수 고 매우 비 침략 적 액체 biopsies4,5와 호환 합니다. 그러나, 현재 ddPCR 분석 실험은 주로 선험적으로알려진 돌연변이 감지 하도록 설계 되었습니다. 이 심각 하 게 돌연변이 알 수 없는 경우 검색 도구로 ddPCR 사용 하 여를 제한 합니다. 실제로, 기존의 ddPCR 디자인, 야생 형 대립 유전자 (WT 프로브)를 인식 하는 가수분해 프로브 인식 하는 돌연변이 체 대립 유전자 (MUT 프로브) (그림 1A) 특정 조사와 경쟁 한다. 높은 선호도 조사 서식 파일을 hybridizes 하 고 해당 대립 유전자의 성격을 나타내는 그것의 fluorophore를 해제 합니다. 각 작은 물방울에 대 한 얻은 형광 데이터 WT 및 MUT 프로브 다른 차원에 의해 방출 하는 형광을 나타내는 산 점도에 구상 될 수 있다. 기존의 ddPCR 분석 결과 대 한 일반적인 결과의 도식 표현 그림 1A에 제공 됩니다. 이 예제에서는 블루 클라우드 빨간 구름 방울 있는 MUT 대립 유전자 증폭 되었고 MUT 프로브에 의해 식별에 해당 하는 반면 WT 프로브로 식별 하는 WT 대립 유전자를 포함 하는 작은 물방울에 해당 합니다. 반응에서 로드 하는 DNA의 양에 따라서 WT와 MUT amplicons 포함 된 더블 긍정적인 방울 (녹색 구름) 나타날 수 있습니다. 빛 회색 구름 빈 물방울에 해당합니다.
대부분의 플랫폼 fluorophores (보통 2, 최대 5만)의 제한 된 수의 검출에 대 한 허용, 기존의 ddPCR의 처리량 제한 됩니다. 따라서, 여러 개의 인접 한 돌연변이와 영역을 대상으로 기술적으로 도전적인 멀티플렉스 ddPCR 분석 실험 또는 동시에 각 돌연변이 대상으로 하는 여러 반응의 사용의 디자인을 필요 합니다. 그것은 잠재적으로 독특한 WT 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 대상 지역 내에서 어떤 유전 변경 감지 수 있습니다 드롭 ddPCR 전략이이 제한 극복. 첫 번째 프로브 (Probe 1) 커버 비 변수 시퀀스, 대상 지역 및 두 번째 프로브 (Probe 2)은 돌연변이 대상 영역의 WT 시퀀스에 보완 예정 (그림 1B). 첫번째 조사 반응에 amplifiable 분자의 총 금액을 단정, 하는 동안 두 번째 프로브 WT 및 MUT 대립 유전자 돌연변이 시퀀스에 최적의 교 잡에 의해 차별. 프로브 2 대상 지역 (단일 또는 여러 개의 뉴클레오티드 대체, 삭제, 등)6에 돌연변이의 여러 종류를 식별할 수 있습니다. 기존의 ddPCR에서 빛 회색 구름 없는 DNA 분자를 포함 하는 작은 물방울에 해당 합니다. 이 유형의 분석 결과에 WT MUT 구름의 최적의 분리는 DNA WT와 MUT 대상 대립 유전자를 포함 하는 작은 물방울만 WT를 포함 하는 작은 물방울에서 구분할 수 없습니다 이후 반응, 로드의 수량에 따라 기억 하는 것이 중요 하다 양식입니다. 따라서,이 분석 결과 대부분 물방울 타겟된 유전자의 둘 이상의 복사본을 포함 해야 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
효율적인 감소 ddPCR 분석 결과, 디자인에 최적화는 중요 한, 그리고 프로토콜을 신중 하 게 따라야 합니다. 뇌관 및 프로브 각 조합의 고유 PCR 반응 효율이 있다. 따라서, 개별 분석 결과 신중 하 게 유효성을 검사할 컨트롤 샘플에 귀중 한 테스트 샘플에 사용 되 고 있다. 최적화 및 유효성 검사 증명 피크 신호 검출 및 특이성 및 감도 평가에 중요 하다. 프로토콜에 설명 된 대로 모든 돌연변이 “프로…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 인 퀴리 SiRIC (그랜트 잉카-DGOS-4654)에 의해 지원 되었다. 저자 또한 비디오에 그녀의 기여에 대 한 캐롤라인 Hego을 감사 하고자 합니다.
Materials
| K2EDTA tube (color code : lavender) | BD | 367863 | EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) | Qiagen | 55114 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) | Qiagen | 937556 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony SP system | Qiagen | 9001297 | fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA |
| QX100 or QX200 reader | Bio-Rad | 186-3003 or186-4003, respectively | The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector |
| QX100 or QX200 droplet generator | Bio-Rad | 186-3002 or 186-4002, respectively | Instrument used for droplet generation |
| C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851196 | Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module |
| Plate sealer | Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ PCR plate sealer |
| DG8 cartridge holder | Bio-Rad | 186-3051 | Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation |
| Droplet generator cartridges and gaskets | Bio-Rad | 186-4007 | Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation |
| PCR supermix | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR supermix for probes (no dUTP) |
| 96-well PCR plates | Eppendorf | 951020362 | 96-well semi-skirted plates |
| Foil seal | Bio-Rad | 181-4040 | Pierceable foil heat seal |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 186-3004 | oil used in the read |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 186-3005 | oil for droplet generation |
| DNA loBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding |
| Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations |
| QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer |
Riferimenti
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