Hydrogenion-mediert siRNA Gene-stanse i voksen sebrafisk hjerte
Summary
Det er fortsatt en stor utfordring å utvikle betinget gen-knockout eller effektiv gen-knockdown i voksen sebrafisk organer. Her kan vi rapportere en protokoll for utøvende hydrogenion-mediert siRNA gen-stanse i voksen sebrafisk hjerte, noe som gir en ny tap-av-funksjonen metoden for å studere voksen organer i sebrafisk og andre modellen organismer.
Abstract
Pattedyr har en svært begrenset evne til å regenerere hjertet etter hjerteinfarkt. Derimot, regenererer voksen sebrafisk hjertet sitt etter apex resection eller cryoinjury, gjør det en viktig modell organisme for hjertet gjenfødelse studier. Men har mangel på tap av funksjon metoder for voksen organer begrenset innsikt i mekanismene bak hjertet gjenfødelse. RNA-interferens via forskjellige leveringssystemer er et kraftig verktøy for å stanse gener i pattedyrceller og modell organismer. Vi har tidligere rapportert at siRNA-innkapslet nanopartikler kunne angi celler og resultere i en bemerkelsesverdig gen-spesifikke knockdown i regenererende voksen sebrafisk hjertet. Her presenterer vi en enkel, rask og effektiv protokoll for dendrimer-mediert siRNA levering og slå av genet i regenererende voksen sebrafisk hjertet. Denne metoden gir en alternativ tilnærming for å bestemme genet funksjoner i voksen organer i sebrafisk og kan utvides til andre modellen organismer også.
Introduction
Hjerteinfarkt er blitt en stor helserisiko, fører til en enorm økonomisk byrde rundt verden1. Voksen pattedyr hjertet ikke klarer å regenerere og fylle det tapte cardiomyocytes på makroskopisk skala etter skaden, fører til dannelse av arr vev og påfølgende hjertesvikt. I motsetning til pattedyr er sebrafisk dugelig av hjertet gjenfødelse, primært gjennom robust hjerteinfarkt spredning etter forskjellige typer hjertet skade, noe som gjør det til en ideell modell organisme for å undersøke molekylære mekanismer av hjertet gjenfødelse 2,3,4,5,6,7,8. Tyde endogene mekanismer er underliggende sebrafisk hjertet regenereringen et spennende område av forskning i jakten på romanen strategier forbedre hjerte gjenfødelse9.
Genetisk manipulasjon metoder er tilgjengelige i sebrafisk. Dette består av morpholinos (MO) som er også mye brukt i frosker, kylling og pattedyr foruten i sebrafisk10,11,12,13. MO har effektiv knockdown av målet genuttrykk i voksen sebrafisk fin, hjernen og netthinnen14,15,16,17,18,19. Låst-nukleinsyre acid (LNA) er en kunstig oligonucleotide brukes til å slå ned endogene genuttrykk ikke bare i sebrafisk embryoer, men også i voksen dyr organer20,21,22, 23 , 24. mangel på effektive tap-av-funksjon metoder for voksnes hjerter er imidlertid en hindring i å studere molekylære mekanismer av organ gjenfødelse. Stede, små-molekylet hemmere eller transgene uttrykk for dominerende-negativ mutanter brukes primært til å blokkere funksjonen til et bestemt gen eller sti å studere dens funksjon i voksen sebrafisk hjertet gjenfødelse25,26 ,27. Men ikke alle gener eller signalveier gjelder for disse metodene.
Små-konflikt RNAs (siRNAs) brukes for tap av funksjon analyse i pattedyrceller og embryo modell organismer, i tillegg til voksen organer for prekliniske studier i dyr modeller28,29,30 , 31 , 32. siRNAs har blitt effektivt brukt til taushet gener i svulster33,34,35 og cardiomyocytes36,37,38,39 ,40 via forskjellige leveringssystemer. Nylig har utviklet vi effektive siRNA-innkapslet hydrogenion gen-stanse i regenererende voksen hjertet med flere forskjellige nanopartikler41,42,43, gir et romanen verktøy for funksjonell studier av gener i voksen sebrafisk organer. Basert på våre tidligere studier41,42,43, presenterer her vi en enkel, praktisk, men kraftig protokoll for siRNA gen-stanse i regenererende voksen sebrafisk hjertet bruke f-PAMAM-PEG-R9 dendrimers. Aldh1a2 (aldehyd dehydrogenase 1 familie, medlem A2) genet ble upregulated etter sebrafisk apex eksisjon og ablasjon av Aldh1a2 blokkert cardiac gjenfødelse44. Her tar vi aldh1a2 genet som et eksempel å teste genet knockdown effektiviteten formidlet av hydrogenion-kapslet siRNA injeksjon. Denne protokollen inneholder en fremgangsmåte for sebrafisk hjertet resection, syntese av nanopartikler og en leveringsmetode på siRNA-innkapslet nanopartikler inn voksen sebrafisk hjertet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebrafisk er fullt i stand til å regenerere forskjellige organer inkludert voksen hjertet5. Mens transgene og genetiske metoder er godt utviklet for å studere genet funksjoner i fosteret av sebrafisk, står etterforskere fortsatt overfor uoverkommelige generere betinget mutant alleler i sebrafisk45,46. Dermed transgene dominerende-negativ mutanter eller små molekyl hemmere brukes ofte til adressen genet funksjoner i voksen sebrafisk org…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. IC Bruce for kritiske kommentarer og lese manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation i Kina (31430059, 31701272, 31730061, 81470399 og 31521062), AstraZeneca Asia, og fremvoksende markedet Innovative medisin og tidlig utvikling.
Materials
| tricaine | Sigma | E10521 | Store at 4°C |
| stereomicroscope | Leica | S8AP0 | |
| sharp forcep | WPI | 14098 | |
| iridectomy scissors | WPI | 501778 | |
| elbow tweezers | Suzhou Liuliu | SE05Cr | |
| α,ω-dipyridyl disulfido polyethylene glycol(Py-PEG-Py) | Biomatrik (Jiaxing) Inc. | 5239 | |
| core of G4.0 polyamidoamine (PAMAM) | Andrews ChemServices | AuCS-297 | |
| vacuum drying equipment | Yiheng | DZF-6020 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine(TCEP) | Alfar Aesar | 51805-45-9 | Causes severe skin burns and eye damage. Causes serious eye damage. |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC900308 | |
| freeze dryer | Martin Christ | Alpha 2-4 Ldplus | |
| NMR spectrometer | Bruker | AV400 | |
| Deuterium oxide(D2O) | J&K | 174611 | |
| NMR sample tube | J&K | WG-1000-7-50 | |
| 3 kDa MWCO ultrafiltration tube | Merck | UFC900308 | |
| sea salts | Instant Ocean® | SS15-10 |
Riferimenti
- Writing Group Members. Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics–2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev Biol. 11, 21 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Parente, V., et al. Hypoxia/reoxygenation cardiac injury and regeneration in zebrafish adult heart. PLoS One. 8 (1), 53748 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Raya, A., et al. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 11889-11895 (2003).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), 18503 (2011).
- Wang, J., et al. The regenerative capacity of zebrafish reverses cardiac failure caused by genetic cardiomyocyte depletion. Development. 138 (16), 3421-3430 (2011).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Burns, C. E., Burns, C. G. Zebrafish heart regeneration: 15 years of discoveries. Regeneration (Oxf). 4 (3), 105-123 (2017).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev Biol. 222 (1), 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene ‘knockdown’ in zebrafish. Nat Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30 (3), 198-200 (2001).
- London, C. A., et al. A novel antisense inhibitor of MMP-9 attenuates angiogenesis, human prostate cancer cell invasion and tumorigenicity. Cancer Gene Ther. 10 (11), 823-832 (2003).
- Kizil, C., Otto, G. W., Geisler, R., Nusslein-Volhard, C., Antos, C. L. Simplet controls cell proliferation and gene transcription during zebrafish caudal fin regeneration. Dev Biol. 325 (2), 329-340 (2009).
- Thummel, R., et al. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo. electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev Dyn. 235 (2), 336-346 (2006).
- Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), 27395 (2011).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415 (2013).
- Craig, S. E., et al. The zebrafish galectin Drgal1-l2 is expressed by proliferating Muller glia and photoreceptor progenitors and regulates the regeneration of rod photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (6), 3244-3252 (2010).
- Thummel, R., Bailey, T. J., Hyde, D. R. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. (58), e3603 (2011).
- Rayburn, E. R., Zhang, R. Antisense, RNAi and gene silencing strategies for therapy: mission possible or impossible. Drug Discov Today. 13 (11-12), 513-521 (2008).
- Seth, P. P., et al. Short antisense oligonucleotides with novel 2′-4′ conformationaly restricted nucleoside analogues show improved potency without increased toxicity in animals. J Med Chem. 52 (1), 10-13 (2009).
- Prakash, T. P., et al. Antisense oligonucleotides containing conformationally constrained 2′,4′-(N-methoxy)aminomethylene and 2′,4′-aminooxymethylene and 2′-O,4′-C-aminomethylene bridged nucleoside analogues show improved potency in animal models. J Med Chem. 53 (4), 1636-1650 (2010).
- Yamamoto, T., Nakatani, M., Narukawa, K., Obika, S. Antisense drug discovery and development. Future Med Chem. 3 (3), 339-365 (2011).
- Itoh, M., Nakaura, M., Imanishi, T., Obika, S. Target gene knockdown by 2′,4′-BNA/LNA antisense oligonucleotides in zebrafish. Nucleic Acid Ther. 24 (3), 186-191 (2014).
- Han, P., et al. Hydrogen peroxide primes heart regeneration with a derepression mechanism. Cell Res. 24 (9), 1091-1107 (2014).
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Lepilina, A., et al. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127 (3), 607-619 (2006).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3 (10), 737-747 (2002).
- de Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Kim, D. H., Rossi, J. J. Strategies for silencing human disease using RNA interference. Nat Rev Genet. 8 (3), 173-184 (2007).
- McCaffrey, A. P., et al. Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nat Biotechnol. 21 (6), 639-644 (2003).
- Raoul, C., et al. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS. Nat Med. 11 (4), 423-428 (2005).
- Hu-Lieskovan, S., Heidel, J. D., Bartlett, D. W., Davis, M. E., Triche, T. J. Sequence-specific knockdown of EWS-FLI1 by targeted, nonviral delivery of small interfering RNA inhibits tumor growth in a murine model of metastatic Ewing’s sarcoma. Cancer Res. 65 (19), 8984-8992 (2005).
- Schiffelers, R. M., et al. Cancer siRNA therapy by tumor selective delivery with ligand-targeted sterically stabilized nanoparticle. Nucleic Acids Res. 32 (19), 149 (2004).
- Yang, X. Z., et al. Systemic delivery of siRNA with cationic lipid assisted PEG-PLA nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 156 (2), 203-211 (2011).
- Ko, Y. T., Hartner, W. C., Kale, A., Torchilin, V. P. Gene delivery into ischemic myocardium by double-targeted lipoplexes with anti-myosin antibody and TAT peptide. Gene Ther. 16 (1), 52-59 (2009).
- Liu, J., et al. Functionalized dendrimer-based delivery of angiotensin type 1 receptor siRNA for preserving cardiac function following infarction. Biomaterials. 34 (14), 3729-3736 (2013).
- Nam, H. Y., Kim, J., Kim, S. W., Bull, D. A. Cell targeting peptide conjugation to siRNA polyplexes for effective gene silencing in cardiomyocytes. Mol Pharm. 9 (5), 1302-1309 (2012).
- Nam, H. Y., McGinn, A., Kim, P. H., Kim, S. W., Bull, D. A. Primary cardiomyocyte-targeted bioreducible polymer for efficient gene delivery to the myocardium. Biomaterials. 31 (31), 8081-8087 (2010).
- Won, Y. W., McGinn, A. N., Lee, M., Bull, D. A., Kim, S. W. Targeted gene delivery to ischemic myocardium by homing peptide-guided polymeric carrier. Mol Pharm. 10 (1), 378-385 (2013).
- Diao, J., et al. PEG-PLA nanoparticles facilitate siRNA knockdown in adult zebrafish heart. Dev Biol. 406 (2), 196-202 (2015).
- Xiao, C., et al. Chromatin-remodelling factor Brg1 regulates myocardial proliferation and regeneration in zebrafish. Nat Commun. 7, 13787 (2016).
- Wang, F., et al. A Neutralized Noncharged Polyethylenimine-Based System for Efficient Delivery of siRNA into Heart without Toxicity. ACS Appl Mater Interfaces. 8 (49), 33529-33538 (2016).
- Kikuchi, K., et al. Retinoic acid production by endocardium and epicardium is an injury response essential for zebrafish heart regeneration. Dev Cell. 20 (3), 397-404 (2011).
- Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise Editing of the Zebrafish Genome Made Simple and Efficient. Dev Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nat Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
- Kesharwani, P., Gajbhiye, V., Jain, N. K. A review of nanocarriers for the delivery of small interfering RNA. Biomaterials. 33 (29), 7138-7150 (2012).
- Luong, D., et al. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 43, 14-29 (2016).
- Luo, K., He, B., Wu, Y., Shen, Y., Gu, Z. Functional and biodegradable dendritic macromolecules with controlled architectures as nontoxic and efficient nanoscale gene vectors. Biotechnol Adv. 32 (4), 818-830 (2014).
- Shcharbin, D., Shakhbazau, A., Bryszewska, M. Poly(amidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert Opin Drug Deliv. 10 (12), 1687-1698 (2013).
