نقل الاجنه طفيف التوغل والتزجيج الجنيني في مرحله الجنين الأمثل في نموذج الأرنب
Summary
وتجري تقييمات مستمرة لتقنيات الإنجاب المساعدة (الفنون) لتحسين النتائج والحد من المخاطر المرتبطة بها. تصف هذه المخطوطة اجراء لنقل الاجنه بالحد الأدنى من التوغل مع بروتوكول فعال للحجز بالتبريد يسمح باستخدام الأرانب كنموذج حيواني مثالي لتكاثر البشر.
Abstract
وتؤثر تقنيات الإنجاب المساعدة (الفنون) ، مثل ثقافة الاجنه في المختبر أو التجميد الجنيني ، علي أنماط التنمية الطبيعية التي تترتب عليها عواقب ما قبل الولادة وبعدها. لضمان البراءة من التطبيقات الفنية ، والدراسات في النماذج الحيوانية ضرورية. الاضافه إلى ذلك ، وكخطوه أخيره ، تتطلب دراسات تنميه الاجنه تقييم قدرتها علي تطوير نسل صحي كامل الأجل. هنا ، لا غني عن نقل الاجنه إلى الرحم للقيام بأي تجربه ذات صله بالفنون.
وقد استخدم الأرنب كنموذج الكائن الحي لدراسة تكاثر الثدييات لأكثر من قرن. بالاضافه إلى قربها الوراثي للأنواع البشرية وحجمها الصغير وتكلفه صيانتها المنخفضة ، فان لها خصائص انجابيه مهمة مثل الاباضه المستحثة ، والتسلسل الزمني للتطور الجنيني المبكر علي غرار البشر والحمل القصير التي تسمح لنا لدراسة عواقب تطبيق الفن بسهوله. وعلاوة علي ذلك ، يتم تطبيق الفنون (مثل حقن السائل المنوي داخل الجنين ، وثقافة الاجنه ، أو التجميد) مع الكفاءة المناسبة في هذا النوع.
باستخدام تقنيه نقل الاجنه بالمنظار وبروتوكول الحفظ بالتبريد المقدمة في هذه المقالة ، ونحن وصف 1) كيفيه نقل الاجنه من خلال تقنيه سهله وطفيفه التوغل و 2) بروتوكول فعال للتخزين علي المدى الطويل من الأرنب الاجنه لتوفير القدرات اللوجستية المرنة الوقت والقدرة علي نقل العينة. وتشير النتائج التي تم الحصول عليها بعد نقل أجنه الأرانب في مراحل تنموية مختلفه إلى ان المستنقع هو المرحلة المثالية لشفاء ونقل أجنه الأرانب. التالي ، فانه يلزم نقل الاجنه الجنينية ، مما يبرر العملية الجراحية. وعلاوة علي ذلك ، يتم بنجاح المزجج الأرنب الاجنه ومنظار نقلها ، مما يثبت فعاليه التقنيات الموصوفة.
Introduction
وبهدف تجاوز العقم البشري أو تحسين نشر الماشية ذات القيمة الجينية العالية والحفاظ علي الموارد الوراثية الحيوانية ، فان مجموعه من التقنيات تسمي مجتمعه تكنولوجيات الإنجاب المساعدة ، مثل الاباضه الفائقة ، في تم تطوير الإخصاب الأنبوبي ، وثقافة الاجنه ، أو التجميد ،1،2. حاليا ، يتم إعطاء العلاجات الهرمونية لتحفيز المبيضين وإنتاج عدد كبير من بصيلات المبيض عدد الجريبات الغاريه1. البويضات التي يتم جمعها من هذه البصيلات يمكن نضجها ، المخصبة ، وتطويرها في المختبر حتى يتم اما بالتبريد أو نقلها إلى الأمهات البديلة3. ومع ذلك ، خلال هذه العلاجات ، ويتعرض الامشاج و تخليق ملقح لسلسله من العمليات غير الفسيولوجية التي يمكن ان تتطلب التكيف الجنين للبقاء علي قيد الحياة في هذه الظروف4،5. هذا التكيف هو ممكن بسبب اللدونة الجنين في وقت مبكر ، والذي يسمح التغييرات الجنينية في التعبير الجيني والبرمجة التنموية6. ومع ذلك ، يمكن ان تؤثر هذه التعديلات علي المراحل اللاحقة من تطور الجنين حتى سن الرشد ، ومن المقبول علي نطاق واسع الآن ان الأساليب والتوقيت وإجراءات التجميد أو الظروف الثقافية تظهر نتائج مختلفه علي مصير الجنين7 , 8. لذلك ، لتوضيح الآثار المستحثة محدده من الفنون ، واستخدام نماذج الحيوانية تتميز جيدا لا مفر منه.
وقد حدثت أول ولادة حيه موثقه ناتجه عن نقل أجنه ثدييه في ال18909. اليوم ، نقل الاجنه (ET) إلى انثي بديله هو خطوه حاسمه في دراسة الآثار الناجمة عن الفن خلال مرحله ما قبل الغرس علي مراحل تطوير الاجنه اللاحقة10. تقنيات ET تعتمد علي حجم والهيكل التشريحي لكل الحيوانية. وفي حاله النماذج الحيوانية الكبيرة الحجم ، كان من الممكن القيام بعمليات ET عن طريق تقنيات ET غير جراحيه لعنق الرحم ، ولكن في قسطرة الأنواع الأصغر حجما من عنق الرحم هي أكثر تعقيدا وتستخدم التقنيات الجراحية في كثير من الأحيان11. ومع ذلك ، يمكن ان يسبب الجراحة ET نزيف التي يمكن ان تضعف زرع ونمو الجنين ، والدم يمكن ان تغزو تجويف الرحم ، مما تسبب في وفاه الجنين10. ولا تزال التقنيات غير الجراحية عبر عنق الرحم تطبق في البشر ، والبالونات ، والأبقار ، والخنازير والفئران12،13،14، 15،16،17، ولكن الجراحية لا تزال تستخدم ETs في أنواع مثل الماعز والأغنام أو الحيوانية الأخرى التي تمثل صعوبات اضافيه10،18،19،20،21، مثل الأرانب (اثنين الاجهزه المستقلة) أو الفئران (حجم صغير). ومع ذلك ، تميل أساليب النقل الجراحية تدريجيا إلى استبدالها بطرق اقل الغازية. واستخدم التنظير الباطني لنقل الاجنه ، علي سبيل المثال ، في الأرانب والخنازير والتاملات الصغيرة18و19و20. ويمكن استخدام هذه الطرق التنظير طفيف التوغل لنقل الاجنه في أمبول عن طريق infundibulum ، وهو أمر ضروري في الأرانب وأظهرت اثار مفيده في بعض الأنواع20. ويستند هذا إلى اهميه الحوار الصحيح بين الجنين والام خلال مراحل الاجنه المبكرة في القناة. وكما ذكر أعلاه ، فان أعاده عرض الاجنه التي تجري في الأرانب اثناء هجره الاجنه من خلال القناة الهوائية ضرورية لتحقيق الاجنه القادرة علي زرع22،23.
نماذج الحيوانية أكبر حجما ، مثل الأبقار ، هي مثيره للاهتمام لان السمات البيوكيميائية وما قبل الغرس مماثله لتلك الموجودة في الأنواع البشرية24. ومع ذلك ، الحيوانية الكبيرة مكلفه للغاية لاستخدامها في التجارب الاوليه ، وتعتبر القوارض نموذجا مثاليا (76 ٪ الكائنات الحية النموذجية هي القوارض) للبحوث المختبرية25. ومع ذلك ، فان نموذج الأرنب يوفر بعض المزايا علي القوارض في الدراسات الانجابيه ، كما ان بعض العمليات البيولوجية الانجابيه التي عرضها البشر هي أكثر تشابها في الأرانب من تلك الموجودة في الفئران. الإنسان والأرانب تقديم مماثله الوراثية الجنينية تنشيط الجينوم ، والذواقة وبنيه المشيمة الأرقاء. الاضافه إلى ذلك ، باستخدام الأرانب فمن الممكن ان نعرف التوقيت الدقيق للإخصاب ومراحل الحمل بسبب الاباضه المستحثة25. الأرنب دورات الحياة قصيرة ، واستكمال الحمل في 31 يوما والوصول إلى سن البلوغ في حوالي 4-5 أشهر ؛ الحيوانية من السهل التعامل معها بسبب سلوكها المنصاع وغير العدواني ، وصيانتها اقتصاديه جدا بالمقارنة مع حساب الأكبر من الماشية. وعلاوة علي ذلك ، من المهم ان نذكر ان الأرانب لديها الرحم المزدوج مع اثنين من cervixes مستقله11،25. هذا يضع الأرنب في وضع تفضيلي ، كما يمكن نقل الاجنه من المجموعات التجريبية المختلفة إلى نفس الحيوانية ، ولكن في قرن الرحم مختلفه. وهذا يتيح لنا مقارنه كل من الآثار التجريبية ، والحد من عامل الامومه من النتائج.
اليوم ، غير الجراحية أساليب ET ليست في استخدامها في الأرنب. بعض الدراسات التي أجريت في أواخر 90s باستخدام تقنيه ET عبر عنق الرحم أسفرت عن انخفاض معدلات التسليم تتراوح بين 5.5 ٪ إلى 20.0 ٪11،26 مقابل 50-65 ٪ من الطرق الجراحية ، من بينها اجراء تنظير البطن الموصوفة من قبل Besenfelder و Brem18. معدلات النجاح المنخفضة لهذه الطرق غير الجراحية ET في الأرانب تتزامن مع عدم وجود أعاده عرض الاجنه اللازمة في القناة ، والتي يتم تجنبها في الناقلات العنقية. هنا ، ونحن وصف فعاله الحد الأدنى من الجراحة بالمنظار ET الاجراء باستخدام الأرانب كنموذج الكائن الحي. هذا الأسلوب يوفر نموذجا لمزيد من البحوث الانجابيه في الحيوانية الكبيرة والبشر.
لان الأرانب لديها نافذه زمنيه ضيقه بشكل خاص لغرس الاجنه ، ET في هذا النوع يتطلب درجه عاليه من التزامن بين المرحلة التنموية للجنين في ET والوضع الفسيولوجي للمستلم27. في بعض الحالات ، بعد العلاج التناسلي الذي يبطئ نمو الجنين (مثل الثقافة الانبوبيه) أو يغير من تقبل بطانة الرحم (مثل علاجات الاباضه) ، لا يوجد تزامن بين الجنين ورحم الام. ويمكن ان تؤثر هذه الحالات سلبا علي النتيجة. للرد في هذه السياقات ، ونحن وصف الفعالة الأرنب مورلي التزجيج البروتوكول الذي يسمح لنا لوقفه ، وتنظيم واستئناف التجارب. وهذه العملية مستصوبه من النواحي اللوجستية للدراسات الانجابيه وتتيح لنا القدرة علي تخزين الاجنه علي المدى الطويل ، مما يسمح بنقلها. الاجراء بالمنظار واستراتيجيات الحفظ بالتبريد تسمح بتخطيط أفضل للدراسات مع عدد اقل من الماشية. التالي ، فان منهجيتنا توفر مزايا صحية واقتصاديه وتتوافق مع مفهوم 3Rs (الاستبدال والتخفيض والصقل) للبحوث الحيوانية مع الهدف المعلن لتحسين العلاج البشري للحيوانات التجريبية. وهكذا ، مع هذه الأساليب ، والأرانب تشكل كائن نموذجي مثالي لاختبارات التكاثر في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
منذ أول حاله الولادة الحية موثقه من الاجنه المنقولة9، وقد أصبحت هذه التقنية وأنواع الأرانب حاسمه في الدراسات الانجابيه. والي جانب ذلك ، تتطلب الدراسات البحثية المتعلقة بالاجنه ، التي تنطوي علي التلاعب والإنتاج والتجميد وما إلى ذلك ، كخطوه أخيره ، تقييم قدره الاجنه علي ت?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل بأموال من وزاره الاقتصاد والقدرة التنافسية في اسبانيا (AGL2017-85162-1-R) وبرنامج البحوث المتعلقة بالعموميات في فالنسيا (PrometeoII 2014/036). نسخه النص الإنكليزي المنقحة من قبل n. Macowan خدمه اللغة الانجليزيه
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 332 | |
| Buprenorphine hydrochloride | Alvet Escartí | 626 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buserelin Acetate | Sigma Aldrich | B3303 | |
| Clorhexidine digluconate soap | Alvet Escartí | 0265DCCJ500B | |
| Clorhexidine digluconate solution | Alvet Escartí | 0265DCCA500B | |
| CO2 | Air Liquide | 99921 | CO2 N48. |
| CO2 Incubator | Fisher scientific | 15385194 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich | W387509 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Sigma Aldrich | D5773 | Without calcium chloride. |
| Electric razor | Oster Golden A5 | 078005-140-002 | |
| Endoscope camera | Optomic Spain S.A | OP-714 | |
| Endoscope trocar with silicone leaflet valve | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 30114GK | Lightweight trocar model. |
| Enrofloxacin | Alvet Escartí | 9993046 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Epicraneal needle 23G | Alvet Escartí | 514056353 | Smaller needles can be also used. |
| Epidural catheter | Vygon corporate | 187.10 | |
| Epidural needle | Vygon corporate | 187.10 | |
| Ethylene Glycol | Sigma Aldrich | 102466-M | |
| Eye ointment | Alvet Escartí | 5273 | |
| Ketamine hydrochloride | Alvet Escartí | 184 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Laparoscopy equipment | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 26003 AA | Hopkins® Laparoscope, 0º-mm straight-viewing laparoscope, 30-cm length, 5-mm working channel. |
| Light source | Optomic Spain S.A | Fibrolux 250 | |
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | P1505XXX | |
| Mechanical CO2 insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | Endoflator® | |
| Meloxicam | Alvet Escartí | 9993501 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Petri dishes, 35-mm | Sigma Aldrich | CLS430165-500EA | |
| Plastic dressing (Nobecutan) | IBOR medica | 7140028 | |
| Plastic Straw 0.25 mL | IMV – technologies | 6431 | |
| Povidone iodide solution | Alvet Escartí | 02656DPYS500S | |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| Silicone tube for insufflator | Karl Storz Endoscopia Ibérica S.A. | 20400040 | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ16F | There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. |
| Sterile Gloves | Alvet Escartí | 087GL010075 | |
| Sterile gown | Alvet Escartí | 12261501 | |
| Sterile mask | Alvet Escartí | 058B15924B | |
| Straw Plug | IMV – technologies | 6431 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Syringe, 1-mL | Fisher scientific | 11750425 | |
| Syringe, 5-mL | Fisher scientific | 11773313 | |
| Urinary catheter | IMV – technologies | 17722 | |
| Waterbath | RAYPA | BAE-4 | |
| Xylazine | Alvet Escartí | 525225 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Rabbits | Universitat Politècnica de València | Line A | Other maternal lines, such as Line V or Line HP can be used. |
Riferimenti
- Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 388-402 (2017).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84 (5), 674-680 (2015).
- Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 411-417 (2017).
- Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 403-410 (2017).
- Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
- Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6 (5), 377-383 (2015).
- Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 128-144 (2015).
- Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 103-117 (2015).
- Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
- Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214 (2014).
- Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116 (2), 235-242 (1999).
- Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32 (4), 291-296 (2014).
- Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
- Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101 (3), e13 (2014).
- Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81 (1), 152-169 (2014).
- Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92 (2), 120-123 (2015).
- Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587 (2015).
- Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
- Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
- Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73 (6), 768-776 (2010).
- Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86 (1), 144-151 (2016).
- Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
- Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48 (6), 967-973 (2013).
- Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4 (2), 170-175 (2002).
- Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144 (1), 1-10 (2012).
- Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45 (9), 577-579 (1998).
- Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (1), (2010).
- Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147 (6), 789-801 (2014).
- Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
- Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32 (4), 440-446 (2016).
- Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
- Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
- Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
- Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
- Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13 (3), 221-228 (1987).
- Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127 (1), 65-71 (2000).
- Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27 (2013).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11 (2), e0148661 (2016).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
- Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
- Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79 (7), 1124-1129 (2013).
- Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
- Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
- Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
- Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
- Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
- Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21 (1), 49-53 (2017).
- Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 483-487 (1982).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos?. Theriogenology. 76 (4), 652-657 (2011).
