הזיהוי של פרומונים ים עגולי הפה באמצעות מונחה Bioassay Fractionation
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבודד ולאפיין את המבנה, חוש הריח, והכוחות תגובה התנהגותית של תרכובות פרומון בשם של הים lampreys.
Abstract
Fractionation מונחה bioassay היא גישת איטרטיבי העושה את התוצאות של bioassays פיזיולוגיים והתנהגותיים להנחות את בידוד וזיהוי של תרכובת פרומון פעיל. שיטה זו הובילה אפיון אותות כימיים מוצלחת שהפונקציה כמו פרומונים במגוון רחב של מיני בעלי חיים. Lampreys ים מסתמכים על חוש הריח לזיהוי פרומונים המתווכות תגובות התנהגותיות או פיזיולוגיים. אנו משתמשים בידע הזה לביולוגיה דגים להניח פונקציות של פרומונים בשם להנחות את בידוד וזיהוי מרכיבים פעילים פרומון. כרומטוגרפיה משמש כדי לחלץ, לרכז, ולהפריד בין תרכובות מהמים ממוזגים. הקלטות אלקטרו-olfactogram (EOG) נערכים כדי לקבוע אילו שברים להפיק תגובות חוש הריח. מבחני התנהגות שני-בחירה מבוך משמשות לאחר מכן לקבוע אם כל אחד השברים מדיף גם פעילים בהתנהגותו, זירוז העדפה. שיטות ספקטרוסקופיות spectrometric לספק את משקל מולקולרי ואת המידע המבני כדי לסייע עם מבנה הבהרה. Bioactivity של תרכובות טהור הוא אישר עם EOG, מבחני התנהגות. התגובות ההתנהגות שנצפתה במבוך בסופו של דבר לאמת באווירה שדה כדי לאשר את תפקידם בסביבה טבעית זרם. אלה bioassays לשחק תפקיד כפול 1) להנחות את התהליך fractionation, 2) לאשר ולהגדיר עוד יותר את bioactivity של רכיבים מבודדים. כאן, אנחנו מדווחים התוצאות נציג של מזהה פרומון ים עגולי הפה המדגימים את התועלת של הגישה מונחה bioassay fractionation. הזיהוי של פרומונים עגולי הפה ים חשוב במיוחד כי אפנון של מערכת התקשורת שלו פרומון הוא בין האפשרויות נחשב לשלוט הצלופח ים פולשנית של האגמים הגדולים רודכב. בשיטה זו ניתן להתאים בקלות לאפיין את התקשורת הכימית במגוון רחב של taxa, לשפוך אור על waterborne. אקולוגיה כימית.
Introduction
פרומונים הם אותות כימיים מסוימים שפורסמו על ידי יחידים שמסייע להם באיתור מקורות המזון, זיהוי טורפים, מתווכים אינטראקציות חברתיות של בני מינו1. פרומון בתקשורת חרקים כבר למד היטב2; עם זאת, זיהוי כימי והתפקוד הביולוגי של פרומונים חוליות ימיים לא נחקרו בהרחבה. ניתן להחיל זהות וידע תפקוד הפרומונים שוחרר כדי להקל על ההתאוששות של מינים מאוימים3,4 או בקרת מזיקים מינים5,6. היישום של טכניקות אלה מחייבת את בידוד ואפיון של רכיבי ביואקטיביות פרומון.
זיהוי פרומון הוא ענף הכימיה מוצר טבעי. התקדמות במחקר פרומון הוגבלה חלקית בשל אופיו של מולקולות פרומון עצמם. פרומונים הן לעיתים קרובות לא יציב, המשוחררים בכמויות קטנות, רק כמה טכניקות דגימה קיימת כדי לזהות כמויות זעירות של נדיפות7,8 או תרכובות מסיסים במים9. גישות לזיהוי פרומונים כוללים 1) הקרנה יישוב של תרכובות ידועות, גליקומיקס 2) ו- fractionation 3) bioassay מונחה. הקרנה יישוב תרכובות ידועות בדיקות תוצרי חילוף החומרים זמינים מסחרית של תהליכים פיזיולוגיים המשוערות לתפקד כמו פרומונים. גישה זו היא הגבלת כי החוקרים בודק רק תרכובות ידוע וזמין. עם זאת, זה הביא זיהוי מוצלח של הורמוני מין אצל דגי זהב שהפונקציה כמו פרומונים10,11,12. גליקומיקס היא גישה זיהוי פרומון השני המבדיל מוצרים מטבולית פוטנציאלי של מולקולה קטנה בתוך המערכת הביולוגית13. השוואה של פרופילים מטבולית של שתי קבוצות (כלומר, פעיל נגד תמצית לא פעילים) מאפשר זיהוי פרופיל מטבולי הפוטנציאלי מ אשר מטבוליט מטוהרים, הובהר המבנה, ואת bioactivity הוא אישר14. אפקטים מוספים או סינרגטי של ניסוחים מורכבים של תערובות מסוים נוטים יותר להיות מזוהה עם גליקומיקס מכיוון מטבוליטים נחשבים ביחד ולא כסדרה של שברים13. ובכל זאת, המימוש של מטבולומיקס מסתמך על הזמינות של הפניות סינתטי כי הנתונים המתקבלים לא להקל על הבהרה של מבנים חדשניים.
Fractionation מונחה bioassay היא גישה משולבת, איטרטיבי המתפרס על שני שדות: כימיה וביולוגיה. גישה זו משתמשת בתוצאות של bioassays פיזיולוגיים והתנהגותיים להנחות את בידוד וזיהוי של תרכובת פרומון פעיל. תמצית גולמי fractionated באמצעות מאפיין כימי (כלומר, גודל מולקולרי, קוטביות, וכו ‘), נבדק עם הקלטות אלקטרו-olfactogram (EOG) ו/או של bioassay. Bioactive הרכיבים מוקרנים מאת לחזור על השלבים של fractionation ו- EOGs ו/או bioassays. המבנים של חומרים פעילים טהורים הם הובהר על ידי שיטות ספקטרוסקופיות ו spectrometric, אשר מספקים את משקל מולקולרי ומידע המבנית לייצר תבנית של המתחם להיות מסונתז. Fractionation מונחה bioassay יכולות להניב מטבוליטים מגוונים, פרומונים שעשויות להיות הרומן עם שלדים כימי ייחודי כי צפויים להיות החזוי של המסלולים biosynthetic הוחלף נגזר.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול fractionation מונחה bioassay נהגו לבודד לאפיין את bioactivity של תרכובות פרומון מין זכר עגולי הפה לים. הצלופח ים (Petromyzon מרינוס) הוא מודל חוליות אידיאלי ללמוד תקשורת פרומון כי דגים אלו יסתמכו על חוש הריח זיהוי סימנים כימיים לתווך ההיסטוריה החיים anadromous שלהם מורכבת משלושה שלבים ברורים: הזחלים, לנוער, למבוגרים. עגולי הפה ים הזחלים מתחפרים סחף בגדות נחלים, לעבור שינוי דרסטי של, להפוך קטינים זה להגר לאגם או אוקיינוס שבו הם הדורות דגים גדולים המארח. לאחר ניתוק מן הדגים המארח, המבוגרים נודדים בחזרה אל נחלים ההשרצה, בהדרכת את הפרומונים נודדות שפורסמו על ידי זרם תושב הזחלים15,16,17,18,19 . זכרים בוגרים ascend לשטח ההשרצה, שחרור של פרומון המין רב רכיבים כדי למשוך חברים, להשריץ לסירוגין במשך כשבוע, זיווה,15,20. הזיהוי של פרומונים עגולי הפה ים חשוב כי אפנון של מערכת תקשורת פרומון הוא בין האפשרויות נחשב כדי לשלוט על lampreys ים פולשנית האגמים הגדולים רודכב21.
Protocol
Representative Results
Discussion
דגים חיים בעולם כימי מלא של תרכובות, ובכל זאת להיות מזוהה. Fractionation מונחה bioassay הוכיחו חיוניים כדי לזהות ולאפיין מולקולות ביו המתווכות אינטראקציות כימיות רבות, כגון אלה הנהוגות סלמון masu ב31פילים אסיאתיים32, ים lampreys33, 34,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים U.S. גיאולוגי סקר האמונד מפרץ ביולוגי תחנת עבור שימוש במתקני המחקר שלהם ואת הצוות של ארה ב דגים, שירות חיות הבר והדיג וקנדה האוקיינוסים למתן lampreys ים. מחקר זה נתמך על ידי מענקים של הנציבות דוגה הימות הגדולות Weiming Li ו- Ke Li.
Materials
| Premium standard wall borosilicate capillaries with filament | Warner Instruments | G150F-4 | recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm) |
| Pipette puller instrument | Narishige | PC-10 | pulls electrodes for EOGs |
| Diamond-tipped glass cutter | Generic | cut tip of electrodes for EOG | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | odorant delivery tube for EOG |
| Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | ESP-M15N | recording electrode holder |
| Reference electrode holder E Series with handle with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm | Warner Instruments | E45P-F15NH | reference electrode holder |
| 1 mm pin | Warner Instruments | WC1-10 | to bridge reference and recording electrode holders |
| 2 mm pin | Warner Instruments | WC2-5 | to bridge reference and recording electrode holders |
| Agar | Sigma | A1296 | molten agar to fill electrodes |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9333 | 3M KCl to fill electrodes and electrode holders |
| Micropipette microfil | World Precision Instruments | MF28G-5 | to fill electrodes and electrode holders |
| L-Arginine | Sigma | A5006 | positive control odorant for EOG |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Water bath | Custom made | N/A | holds odorants for EOG |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) | Syndel USA | Tricaine1G | EOG anesthetic |
| Gallamine triethiodide | Sigma | G8134-5G | EOG paralytic |
| 1 mL syringe | BD Biosciences | 301025 | to administer paralytic |
| Subcutaneous needle 26G 5/8 | BD Biosciences | 305115 | to administer paralytic |
| Roller clamp | World Precision Instruments | 14043-20 | adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth |
| Sodium chloride (NaCl) | J.T. Baker | 3624-05 | for preparation of 0.9% saline |
| V-shaped plastic stand as specimen stage | Custom made | N/A | holds lamprey during EOG |
| Plastic trough | Custom made | N/A | holds V-shaped plastic stand during EOG |
| Scalpel Blades – #11 | Fine Science Tools | 10011-00 | for EOG dissection |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | for EOG dissection |
| Straight ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps |
| Curved ultra fine forceps | Fine Science Tools | 11370-42 | for EOG dissection, Moria MC40B |
| Straight pring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | for EOG dissection |
| Stereomicroscope | Zeiss | Discovery V8 | for EOG dissection |
| Illuminator light | Zeiss | CL 1500 ECO | for EOG dissection |
| Plastic tubing | Generic | to connect re-circulating EOG setup and water baths | |
| Odorant delivery tubing | Custom made | N/A | |
| In line filter and gasket set | Lee Company | TCFA1201035A | |
| Micromanipulators | Narishige | MM-3 | to position electrodes and odorant delivery capillary tube |
| Magnetic holding devices | Kanetec | MB-K | |
| Valve driver | Arduino | custom made | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Electromagnetic valve | Lee Company | LFAA1201618H | valve for odor stimulation |
| NeuroLog AC/DC amplifier | Digitimer Ltd. | NL106 | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| NeuroLog DC pre-amplifier with headstage | Digitimer Ltd. | NL102G | to increase the amplitude of the elictrical signal |
| Low-pass 60 Hz filter | Digitimer Ltd. | NL125 | |
| Digitizer | Molecular Devices LLC | Axon Digidata 1440A | |
| Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software | Molecular Devices LLC | AxoScope version 10.4 | |
| Faraday cage | Custom made | N/A | Electromagnetic noise shielding |
| Two-choice maze | Custom made | N/A | waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner |
| Trash pump | Honda | WT30XK4A | fills maze with water from nearby river |
| Peristaltic pump with tubing | Cole Parmer | Masterflex 07557-00 | to adminster odorants in maze |
| Inverter Generator | Honda | EU1000i | powers perstaltic pump |
| Release cage | Custom made | N/A | used to acclimate lamprey in the maze |
| Mesh | Generic | used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers | |
| Buckets (5 gallon) | Generic | to mix odorants | |
| Flow meter | Marsh-McBirney | Flo-Mate 2000 | to measure discharge |
| XAD 7 HP resin | Dow chemical | 37380-43-1 | for extraction of conditioned water |
| Methanol | Sigma | 34860 | for extraction of conditioned water |
| Water bath | Yamato | BM 200 | for extraction of conditioned water |
| Freeze dryer | Labconco | CentriVap Concentrator | for extraction of conditioned water |
| chloroform | Sigma | CX1050 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 70-230 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Silica gel 230-400 mesh | Sigma | 112926-00-8 | for isolation of fraction pools |
| Pre-coated silica gel TLC plates | Sigma | 99571 | for isolation of fraction pools |
| anisaldehyde | Sigma | A88107 | for isolation of fraction pools |
| Sephadex LH-20 | GE Healthcare | 17-0090-01 | for isolation of fraction pools |
| Amberlite XAD 7 HP resin | Sigma | XAD7HP | for extraction of conditioned water |
| 4, 2.5L capacity glass columns | Ace Glass Inc. | 5820 | for extraction of conditioned water |
| Acetone | Sigma | 650501 | for extraction of conditioned water |
| TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) | Waters Co. | N/A | for structure elucidation |
| Binary HPLC pump | Waters Co. | 1525 | for isolation of fraction pools/compounds |
| Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) | Agilent | N/A | for structure elucidation |
| Rotovap drying system | Buchi | RII | for extraction of conditioned water |
| UV lamp (254 nm) | Spectronics Co. | ENF-240C | for thin layer chromatography |
Riferimenti
- Wyatt, T. D. . Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , (2014).
- Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
- Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
- Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
- Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
- Cheng, Y. -. n., Wen, P., Dong, S. -. h., Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
- Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. . Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , (2013).
- Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
- Stacey, N., Sorensen, P. . Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , (2011).
- Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
- Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
- Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
- Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
- Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
- Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
- Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
- Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
- Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour?. Animal Behaviour. 78, (2009).
- Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
- Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , 651-704 (2013).
- Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
- Hird, S. J., Lau, B. P. -. Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
- Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
- Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692 (2007).
- Kaiser, B., Wright, A. . Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , (2008).
- Breitmaier, E., Sinnema, A. . Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , (1993).
- Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
- Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
- Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , (2018).
- Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
- Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
- Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
- Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
- Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
- De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
- De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
- Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
- Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).
