Выявление и изоляция Oligopotent и Lineage, совершенные миелоидного предшественники костного мозга мыши
Summary
Мы показали, как идентифицировать и изолировать 6 подмножеств миелоидного прародителей из мышиных костного мозга с помощью комбинации магнитных и флуоресценции, сортировка (MACS и СУИМ). Этот протокол может использоваться для в vitro assays культуры (метилцеллюлоза или жидкости культуры), в естественных условиях приемных передачи экспериментов и РНК/белка анализа.
Abstract
Миелоидные прародителей, которые дают нейтрофилов, моноцитов и дендритных клеток (DCs) могут быть определены в и изолированы от костного мозга мышей для гематологических и иммунологические анализы. Например исследования клеточном и молекулярном свойств миелоидного progenitor населения можно выявить механизмы, лежащие в основе лейкозных преобразования, или продемонстрировать, как иммунная система реагирует на патогенные воздействия. Ранее описанных потока цитометрии стратегии для идентификации миелоидного progenitor позволили значительных успехов во многих областях, но фракций, которые они определяют весьма неоднородны. Наиболее часто используемые стробирования стратегии определить костного фракций, которые обогащаются для желаемого населения, но и содержат большое количество «заражая» прародителей. Наши недавние исследования решили большую часть этой неоднородности и протокол, который мы представляем здесь позволяет изоляции 6 субпопуляции oligopotent и совершенные линии миелоидного прародителей от 2 ранее описанных костного дробей. Протокол описывает 3 этапа: 1) изоляции костного клеток, 2) обогащения гемопоэтических прародителями сортировки магнитные активации клеток (линии истощение, MACS), и 3) идентификация миелоидного progenitor подмножеств подачей cytometry (включая флуоресценции активированный ячейку Сортировка, FACS, при необходимости). Этот подход позволяет прародитель квантификации и изоляции для различных приложений в пробирке и в естественных условиях и уже принесли Роман понимание путей и механизмов нейтрофилов, моноцитов и DC дифференциации.
Introduction
Моноциты, нейтрофилов и дендритных клеток (DCs) являются миелоидных клеток, возникающих от гемопоэтических прародителями, главным образом в костном мозге, этот процесс называется myelopoiesis. Общие миелоидного прародителями (CMPs) имеют потенциал для производства миелоидных клеток, а также megakaryocytes и эритроцитов, но не лимфоидных клеток. Предшественники гранулоцитов и моноцитов (ГИП), которые являются производными от CMPs, производят гранулоцитов и моноцитов, но потеряли мегакариоцитов и эритроцитов потенциал. Моноциты и классические и плазмоцитарная DCs (cDCs/PDC) также считается вытекают из общих прародителей, известный как предшественники Моноцит DC (MDPs), которые производятся CMPs. постепенное ограничение потенциал линии в конечном итоге приводит родословную, совершенные прародители: предшественники гранулоцитов, моноцитов прародителями и Предшественники дендритных клеток (рис. 1).
Вайсман и коллеги сообщили, что CMPs находятся в Линь– c комплект+ Sca-1– (ЛКС–) CD34 FcγRЛо часть костного мозга мыши, в то время как ГИП содержатся в CD34 ЛКС– + + FcγR Привет часть1. Однако эти «КПВ» и «GMP» фракции являются весьма разнородными. Например «GMP» фракции также содержит восходящей линии, совершенные гранулоцитов и моноцитов прародителями1,2. MDPs отдельно сообщается CX3CR1+ Flt3+ CD115+ прародителей, которые также выразить CD34 и FcγR3,4. MDPs привести к cDC/pDC производство общих DC прародителями (CDP), сообщившие выразить более низкие уровни c-Kit (CD117) и не включаются в ЛКС– часть5.
Ранее предполагалось, что моноциты возникают по одной дорожке (CMP-GMP-MDP-Моноцит). В соответствии с этой модели, совершенные Моноцит прародителями, производимые ГИП (названный Моноцит прародителями, м/с)2 и MDPs (названный общих Моноцит прародителями, cMoPs)6 , по-видимому, те же клетки на основе общей поверхности маркер выражения . Однако мы недавно продемонстрировали, что моноциты производятся независимо ГИП и MDPs и были в состоянии провести различие между депутаты и cMoPs сингл клеточной РНК последовательности7.
Мы недавно изменен Вайсман «КПВ» и «GMP» стробирования стратегии для выявления 6 подфракций костного C57BL/6J мыши, содержащих различные oligopotent и совершенные линии миелоидного progenitor подмножеств. Мы впервые сообщили, что окрашивание для Ly6C и CD115 позволяет изоляции oligopotent ГИП, так как предшественники гранулоцитов (GPs) и Моноцит прародителями (MPs и cMoPs, который мы в настоящее время не в состоянии отделить) от «GMP» часть2 (ЛКС – CD34+ FcγRПривет ворота; Рисунок 1). Впоследствии мы показали, что MDPs преимущественно находятся в «КПВ» фракции (CD34 ЛКС– + FcγRЛо ворота), который также содержит Flt3+ CD115Ло и Flt3– подмножеств7 (Рисунок 1 ). CMP-Flt3+ CD115Ло фракция дает ГИП и MDPs после приемных передачи. CMP-Flt3– подмножество содержит прародителей, которые представляются промежуточные между CMP-Flt3+ CD115Ло клетки и ГИП. В отличие от MDPs CMP-Flt3+ CD115Ло и CMP-Flt3– фракции также обладают мегакариоцитов и эритроцитов потенциал.
Важно отметить, однако, что это в настоящее время неясно ли «КПВ» фракции содержат прародителей, которые действительно oligopotent (например, отдельных ячеек в CMP-Flt3+ CD115Ло фракции обладают нейтрофилов, Моноцит, DC, мегакариоцитов и потенциальных эритроцитов), или альтернативно, составляют смесь прародителями с более ограниченным потенциалом линии. Колонии, формируя assays (метилцеллюлоза культуры) показали клетки с гранулоцитарный (нейтрофилов), эритроцитов, моноцитов и мегакариоцитов потенциальных (ГЭММ клетки) в «СС», CMP-Flt3+ CD115Ло и фракции CMP-Flt3– 1 ,7, но не позволяют оценку потенциала постоянного тока. В отличие от колонии, формируя assays продемонстрировал существование oligopotent ГИП (предшественники нейтрофилов и моноцитов потенциальных) в «GMP» часть1,2, и это подтверждается недавно одноклеточного транскриптомики анализ8. Это не известно в настоящее время, однако, является ли эти oligopotent ГИП также производить другие гранулоцитов (эозинофилов, базофилов и тучных клеток).
На основании этих исследований, мы теперь продемонстрировать как 7 поверхности маркеры (c комплект Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C и CD115), может использоваться для идентифицировать и изолировать эти 6 подмножества oligopotent и совершенные линии миелоидного прародителями. Протокол, описанные здесь может применяться для анализов в vitro культуры (метилцеллюлоза или жидкости культуры), в естественных условиях приемных передачи эксперименты в мышей и молекулярный анализ (насыпных и одноклеточного последовательности РНК, Западный blotting, и т.д.).
Протокол состоит из 3 этапов: 1) подготовка подвески одной клетки костного мозга клетки, 2) обогащения гемопоэтических прародителями (сортировки) магнитные активации клеток и 3) выявления и изоляции, при желании, прародитель подмножеств потоком цитометрии (с использованием анализатора или сортировщик, в соответствующих случаях). Первым шагом является изоляция клетки костного мозга от бедра и tibias Усыпленных мышей и похож на другие ранее описанные протоколы9. Затем образец обогащен для стволовых и прогениторных клеток с помощью коктейль антител против клеток поверхностных маркеров эритроцитов, нейтрофилы, моноциты, лимфоциты и т.д., чтобы истощить дифференцированных клеток. Это не является обязательным, но настоятельно рекомендуется оптимизировать обнаружения подмножеств прародителю и уменьшить количество антител, необходимых для идентификации прародителем и время, необходимое для проточной цитометрии. Родословная истощения протокол ниже описывает Magnetic-Activated ячейку Сортировка (ПДК) с помощью мыши Lineage ячейки истощение Kit (который содержит биотинилированным антитела CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 и тер-119, плюс анти биотин микрошарики) и автоматизированных магнитный сепаратор. Последним шагом является идентификация (и сортировки, если это необходимо) Прародитель подмножеств подачей cytometry. Группа антител, описанных ниже (см. также таблицу 1) была разработана для использования в проточный цитометр (анализатор или Сортировщике) с 4 лазеры (405 нм, 488 нм, 561 Нм, 640 Нм).
Рисунок 1: нейтрофилов, моноцитов и DC прародителями и дифференциация путей. Недавно пересмотренная модель myelopoiesis7 иллюстрирован, Вайсман ворота для «CMPs» (синий) и «ГИП» (зеленый)1 обложил. Эта цифра была изменена Яньес et al. 20177. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Вайсман, стробирование стратегия для мыши миелоидного progenitor идентификации1 был золотым стандартом для иммунологов и гематологи почти 20 лет, но сейчас очевидно, что «КПВ» и «GMP» ворота являются весьма разнородными и более точные шлюзовые стратегии необходимы. Протокол, кот?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот протокол был разработан с использованием средств от Совета управляющих регенеративной медицины института в медицинский центр Седарс-Синай (HSG), карьеру в иммунологии стипендий от Американской ассоциации иммунологов (Ай и HSG) и ученый награду от Американского общества гематологии (для AY). Мы благодарим основной поток Cytometry в медицинский центр Седарс-Синай для помощи с СУИМ сортировки.
Materials
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
Riferimenti
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).
- Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
- Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
