Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark
Summary
Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.
Abstract
Myeloische Vorläuferzellen, die Neutrophilen, Monozyten und dendritischen Zellen (DCs) ergeben können identifiziert und isoliert aus dem Knochenmark von Mäusen für hämatologischen und immunologischen Analysen. Beispielsweise können Studien über die zellulären und molekularen Eigenschaften der myeloischen Vorläuferzellen Bevölkerung enthüllen Mechanismen leukämischen Transformation oder zeigen, wie das Immunsystem reagiert auf Erreger Exposition. Zuvor beschriebenen Flow Cytometry Strategien zur myeloischen Vorläuferzellen Identifikation konnten erhebliche Fortschritte in vielen Bereichen, aber die Fraktionen, die sie identifizieren sind sehr heterogen. Die am häufigsten verwendeten gating Strategien definieren Knochenmark Brüche, die sind für die gewünschte Bevölkerung bereichert, sondern auch zahlreicher “verunreinigen” Vorfahren enthalten. Unsere jüngsten Studien haben viel von dieser Heterogenität gelöst und das Protokoll präsentieren wir hier erlaubt die Isolation der 6 Subpopulationen von Oligopotent und Lineage-committed myeloische Vorläuferzellen von 2 oben beschrieben Knochenmark Brüche. Das Protokoll beschreibt 3 Phasen: (1) Isolierung von Knochenmark Zellen, (2) Bereicherung für hämatopoetische Vorläuferzellen von magnetisch aktivierte Zellsortierung (Linie Abbau von MACS) und (3) Identifikation der myeloischen Vorläuferzellen Teilmengen von Durchflusszytometrie (einschließlich Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren, FACS, falls gewünscht). Dieser Ansatz ermöglicht Stammvater Quantifizierung und für eine Vielzahl von in Vitro und in Vivo Anwendungen isoliert und hat bereits neue Einblick in die Wege und Mechanismen der Neutrophilen, Monocyte und DC Differenzierung geführt.
Introduction
Monozyten, Neutrophilen und dendritischen Zellen (DCs) sind myeloische Zellen, die aus hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmark, in erster Linie durch einen Prozess namens Myelopoiesis entstehen. Gemeinsamen myeloische Vorläuferzellen (CMPs) haben das Potenzial, myeloische Zellen, als auch Megakaryozyten und Erythrozyten, aber nicht lymphoiden Zellen zu produzieren. Granulozyten-Monocyte Stammväter (GVP), die von CMPs abgeleitet sind, Granulozyten und Monozyten zu produzieren, aber Megakaryocyte und Erythrozyten mögliche verloren haben. Monozyten und klassische und plasmazytoide DCs (cDCs/pDCs) sind auch gedacht, um ergeben sich aus gemeinsamen Vorfahren bekannt als Monocyte-DC Stammväter (MDPs), die entstehen durch CMPs. schrittweise Einschränkung der Linie Potenzial letztlich zu Lineage-committed führt Vorfahren: Granulozyt Stammväter, Monocyte Stammväter und dendritischen Zellen Stammväter (Abbildung 1).
Weissman und Kollegen berichteten, dass CMPs im Lin– c-Kit+ Sca-1– (LKS–) CD34 gefunden werden+ FcγRlo Bruchteil der Maus Knochenmark, während GVP in der LKS– CD34 enthalten sind+ FcγR Hallo Bruchteil1. Jedoch sind diese “CMP” und “GMP” Fraktionen sehr heterogen. Beispielsweise enthält der “GMP” Bruch auch Lineage-committed Granulozyten Stammväter und Monocyte Stammväter1,2. MDPs wurden separat berichtet, dass CX3CR1+ Flt3+ CD115+ Vorfahren, die auch CD34 und FcγR3,4Ausdrücken. MDPs geben Anlass zu cDC/pDC-Herstellung von gemeinsamen DC Stammväter (CDPs), die untere Ebenen des c-Kit (CD117) Ausdrücken gemeldet wurden und sind nicht in den LKS– Teil5enthalten.
Zuvor war davon auszugehen, dass Monozyten über einen einzigen Weg (CMP-GMP-MDP-Monocyte) entstehen. Einklang mit diesem Modell, Monocyte begangen Stammväter, produziert von GVP (benannt Monocyte Stammväter, m/s)2 und MDPs (benannt gemeinsame Monocyte Vorfahren, cMoPs)6 scheinen die gleichen Zellen auf der Grundlage der gemeinsamen Oberfläche Marker Ausdruck . Aber wir vor kurzem gezeigt, dass Monozyten unabhängig von GVP und MDPs produziert werden, und konnten durch einzellige RNA Sequenzierung7m/s und cMoPs unterscheiden.
Wir vor kurzem verändert die Weissman “CMP” und “GMP” gating Strategie um 6 Unterfraktionen C57BL/6J Maus Knochenmark mit verschiedenen Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen Teilmengen zu identifizieren. Wir zunächst berichtet, dass für Ly6C und CD115 Färbung die Isolation der Oligopotent GVP und Granulozyten Stammväter (GPs) sowie Monocyte Stammväter (m/s und cMoPs, die wir derzeit nicht in der Lage erlaubt, zu trennen sind) aus dem “GMP” Teil2 (LKS – CD34+ FcγRHallo Tor; ( Abbildung 1). Wir später gezeigt, dass MDPs überwiegend in der “CMP” Fraktion gefunden werden (CD34 LKS– + FcγRlo Tor), die enthält auch Flt3+ CD115lo und Flt3– Teilmengen7 (Abbildung 1 ). Die CMP-Flt3+ CD115lo Bruchteil ergibt GVP und MDPs Adoptiv Übergabe. Die CMP-Flt3– Teilmenge enthält Stammväter, die Vermittler zwischen CMP-Flt3+ CD115lo Zellen und GVP zu sein scheinen. Im Gegensatz zu MDPs besitzen die CMP-Flt3+ CD115lo und CMP-Flt3– Fraktionen auch Megakaryocyte und potenzielle Erythrozyten.
Es ist wichtig, Beachten jedoch, dass es derzeit unklar ist, ob die “CMP” Fraktionen Vorfahren enthalten, die sind wirklich Oligopotent (z. B. einzelne Zellen innerhalb der CMP-Flt3+ CD115lo Bruch, die Neutrophilen, besitzen Monocyte, DC Megakaryocyte und potenzielle Erythrozyten), oder alternativ eine Mischung aus Vorfahren mit engeren Linie Potenzial umfassen. Koloniebildenden Assays (Methylcellulose Kulturen) offenbart Zellen mit Granulozyten (Neutrophilen), Erythrozyten, Monocyte und potenzielle Megakaryocyte (GEMM Zellen) in der “CMP” CMP-Flt3+ CD115lo und CMP-Flt3– Fraktionen1 ,7, aber nicht zulassen, dass die Bewertung des DC-Potentials. Im Gegensatz dazu koloniebildenden Assays zeigte die Existenz von Oligopotent GVP (Stammväter mit Neutrophilen und potenzielle Monocyte) im “GMP” Bruchteil1,2, und dies wird unterstützt durch den letzten einzellige transkriptomischen Analyse8. Es ist nicht aktuell, aber bekannt, ob diese Oligopotent GVP auch andere Granulozyten (Eosinophile, Basophils und Mastzellen produzieren).
Basierend auf diesen Studien zeigen wir nun wie 7 Marker (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C und CD115) Oberfläche lässt sich identifizieren und isolieren diese 6 Teilmengen von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen. Das hier beschriebene Protokoll kann angewendet werden, für in-vitro- Kultur Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente bei Mäusen und molekulare Analyse (Bulk- und einzellige RNA-Sequenzierung, Western blotting, usw.).
Das Protokoll besteht aus 3 Phasen: (1) Vorbereitung einer einzelnen Zelle Suspension des Knochenmarks Zellen, (2) Bereicherung für hämatopoetische Vorläuferzellen (magnetisch aktivierte Zellsortierung), und (3) Identifizierung und Isolierung, falls gewünscht, der Stammvater Teilmengen von Flow zytometrie (mit einem Analysator oder einen Sorter je nach Bedarf). Der erste Schritt ist die Isolierung von Knochenmarkzellen aus dem Oberschenkelknochen und Schienbeine euthanasierten Mäuse und ist vergleichbar mit anderen zuvor beschriebenen Protokolle9. Als nächstes wird die Probe für die Stamm- und Vorläuferzellen Zellen mit einem Cocktail von Antikörpern gegen Zelle oberflächenmarker der Erythrozyten, Neutrophilen, Monozyten, Lymphozyten usw. , die differenzierte Zellen zum Abbau bereichert. Dies ist nicht obligatorisch, aber dringend empfohlen, Erkennung der Stammvater Teilmengen zu optimieren und reduzieren die Menge der Stammvater Identifizierung benötigten Antikörper und der Zeitaufwand für Durchflusszytometrie. Die Linie Erschöpfung Protokoll unten beschreibt Magnetic-Activated Zelle Sortieren (MACS) mit einem Maus-Linie Zelle Erschöpfung-Kit (enthält biotinylierte Antikörper gegen CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, und Ter-119, plus Anti-Biotin Microbeads) und eine automatisierte Magnetabscheider. Der letzte Schritt ist die Identifizierung (und sortieren, wenn gewünscht) der Stammvater Teilmengen von Durchflusszytometrie. Die Antikörper-Panel unten beschrieben (siehe auch Tabelle 1) wurde entwickelt, um in einem Durchflusszytometer (Analysator oder Sortierer) mit 4 Laser verwendet werden (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
Abbildung 1: Neutrophilen, Monocyte und DC Stammväter und Differenzierung Wege. Die kürzlich überarbeitete Modell der Myelopoiesis7 ist mit die Weissman Tore für “CMPs” (blau) und “GVP” (grün)1 überlagert dargestellt. Diese Zahl wurde von Yáñez Et Al. 20177geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Weissman Anspritzung Strategie für Maus myeloischen Vorläuferzellen Kennung1 wurde der Goldstandard für Immunologen und Hämatologen seit fast 20 Jahren, aber es ist nun offensichtlich, dass die “CMP” und “GMP” Tore sehr heterogen und präziser sind Gating Strategien sind erforderlich. Das Protokoll, das wir hier beschrieben haben ermöglicht die Identifizierung der Oligopotent und Lineage-committed Teilmengen in den Mäusen C57BL/6J für genauere Quantifizierung der spezifischen myeloische…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Protokoll wurde entwickelt mit Mittel aus dem Vorstand der Gouverneure Regenerative Medizin Institut am Cedars-Sinai Medical Center (HSG), eine Karriere in der Immunologie Gemeinschaft von der American Association Immunologen (AY und HSG) und ein Scholar Award aus die American Society of Hematology (zu AY). Wir danken den Flow Cytometry Kern am Cedars-Sinai Medical Center für Hilfe mit FACS sortieren.
Materials
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
Riferimenti
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).
- Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
- Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
