זיהוי ובידוד של Oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית ממח העצם העכבר
Summary
נדגים כיצד לזהות ולבודד 6 קבוצות משנה של אבות מיאלואידית ממח העצם מאתר באמצעות שילוב של מגנטי קרינה פלואורסצנטית מיון (מקינטוש ו- FACS). פרוטוקול זה יכול לשמש in vitro לקשרי תרבות מבחני (תרבויות methylcellulose או נוזל), ויוו המאמצת העברת הניסויים של RNA/חלבון ניתוחים.
Abstract
אבות מיאלואידית כי תשואות נויטרופילים ומונוציטים, תאים דנדריטים (Dc) יכול להיות מזוהה ב והיא מבודדת ממח העצם של עכברים עבור ניתוחים hematological ו. לדוגמה, מחקרים של המאפיינים תאית ומולקולרית של אוכלוסיות קדמון מיאלואידית ניתן לחשוף את המנגנונים שבבסיס הטרנספורמציה לוקמיה או להדגים כיצד המערכת החיסונית מגיבה לחשיפה הפתוגן. בעבר אסטרטגיות cytometry זרימה שתואר עבור זיהוי קדמון מיאלואידית אפשרו התקדמות משמעותית בתחומים רבים, אך שברים שהם מזהים הטרוגנית מאוד. אסטרטגיות המגביל הנפוצות ביותר מגדירים מח העצם שברים מועשר עבור האוכלוסיות הרצוי, אך גם להכיל מספרים גדולים של אבות “מזהם”. מחקרים אחרונים שלנו פתרו את רוב זה הטרוגניות, פרוטוקול שאנו מציגים כאן מתירה את ניתוקה של 6 subpopulations של oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית 2 שתואר קודם לכן מח העצם שברים. הפרוטוקול מתאר 3 שלבים: 1) בידוד של מח העצם תאים, 2) העשרה עבור אבות hematopoietic על-ידי מגנטי תא לפעיל על-מיון (דלדול שושלת היוחסין מאת מקינטוש) ולאחר 3) זיהוי של קדמון מיאלואידית קבוצות משנה על-ידי cytometry זרימה (כולל קרינה פלואורסצנטית תא לפעיל על-מיון, FACS, במידת הצורך). גישה זו מאפשרת כימות קדמון ובידוד למגוון רחב של יישומי בתוך חוץ גופית וויוו , כבר הניב תובנות הרומן משעולים, מנגנונים של נויטרופילים, מונוציט DC בידול.
Introduction
ומונוציטים, נויטרופילים, תאים דנדריטים (Dc) הם התאים מיאלואידית הנובעים מן אבות hematopoietic, בעיקר במח העצם, על ידי תהליך הנקרא myelopoiesis. אבות מיאלואידית משותף (CMPs) יש פוטנציאל לייצר התאים מיאלואידית, כמו גם megakaryocytes, אריתרוציטים, אבל בתאי הלימפה לא. גרנולוציט-מונוציט אבות (Gmp), אשר נגזרות CMPs, להפיק גרנולוציטים ומונוציטים, אך איבדו מגקריוציט של כדוריות דם אדומות פוטנציאליים. ומונוציטים הקלאסית plasmacytoid בקרי קבוצת מחשבים (cDCs/שיתפקדו) הם גם חשבו נובעים אבות נפוץ הידוע בשם אבות מונוציט-DC (MDPs), המיוצרים על ידי הדרגתי ההגבלה של פוטנציאל שושלת היוחסין בסופו של דבר התוצאה ביצע השושלת CMPs. אבות: אבות גרנולוציט מונוציט אבות, אבות תא דנדריטי (איור 1).
וייסמן ועמיתיו דיווחו כי CMPs נמצאים בערכה לין– c-+ Sca-1– (ביירד–) CD34+ FcγRהלאו שבר של העכבר מח העצם, ואילו Gmp הכלולים CD34 ביירד– + FcγR היי חלק1. עם זאת, אלו שברים “CMP” ו- “GMP” הם מאוד הטרוגנית. למשל, השבר “GMP” מכיל גם גרנולוציט ביצע לשושלת אבות מונוציט אבות1,2. MDPs דווחו בנפרד כדי להיות CX3CR1+ Flt3+ CD115+ אבות כי גם אקספרס CD34 ו FcγR3,–4. MDPs להצמיח cDC/pDC-הפקת נפוצות DC אבות (CDPs), אשר דווחו לבטא רמות נמוכות יותר של c-Kit (CD117), לא נכללות שבר ביירד– 5.
בעבר והונח ומונוציטים להיווצר באמצעות נתיב יחיד (CMP-GMP-MDP-מונוציט). בקנה אחד עם זה אבות מודל, ביצע מונוציט מתוצרת Gmp (על שם אבות מונוציט, MPs)2 ו- MDPs (על שם נפוץ מונוציט אבות, cMoPs)6 שנראה אותם התאים על בסיס משותף סמן משטח ביטוי . עם זאת, אנחנו לאחרונה הוכיח כי ומונוציטים מיוצרים באופן עצמאי על ידי Gmp ו MDPs, היו מסוגלים להבחין בין MPs cMoPs על ידי רצפי RNA בתא יחיד7.
אנחנו ששינה לאחרונה את ויסמן “CMP” ואסטרטגיה “GMP” חסימה כדי לזהות subfractions 6 של מח העצם של העכבר C57BL/6J המכילה oligopotent שונים, ביצע שושלת היוחסין קדמון מיאלואידית קבוצות משנה. קודם דיווחנו כי צביעת עבור Ly6C ו- CD115 מתירה את ניתוקה של oligopotent Gmp, וכן גרנולוציט אבות (GPs) של אבות מונוציט (MPs והן cMoPs, אשר כעת אין אפשרות להפריד) שבר “GMP”2 (ביירד – CD34+ FcγRהיי שער; איור 1). לאחר מכן להדגים MDPs מצויים בעיקר השבר “CMP” (CD34 ביירד– + FcγRהלאו שער), אשר מכיל גם Flt3+ CD115הלאו , Flt3– קבוצות משנה7 (איור 1 ). CMP-+ CD115הלאו שבר Flt3 התשואות Gmp והן MDPs בעת העברה המאמצת. המשנה CMP-Flt3– מכיל אבות כי נראה ביניים בין CMP-Flt3+ CD115הלאו תאים Gmp. בניגוד MDPs, CMP-Flt3+ CD115הלאו והן שברים CMP-Flt3– גם בעלי מגקריוציט כדוריות דם אדומות פוטנציאליים.
חשוב לציין, עם זאת, כי זה כרגע לא ברור אם השברים “CMP” מכילים אבות כי הם באמת oligopotent (למשל, תאים בודדים בתוך CMP-+ CD115הלאו שבר Flt3 שקיימים נויטרופילים, מונוציט, DC, מגקריוציט, פוטנציאל כדוריות דם אדומות), או לחלופין, מהווים תערובת של אבות עם פוטנציאל שושלת היוחסין מוגבל יותר. המושבה ויוצרים מבחני (methylcellulose תרבויות) חשפה תאים עם גרנולוציט (נויטרופילים), כדוריות דם אדומות, מונוציט מגקריוציט פוטנציאליים (תאי GEMM) ב- “CMP,” CMP-Flt3+ CD115הלאו ושברים CMP-Flt3– 1 ,7, אך אינן מתירות את ההערכה של פוטנציאל DC. לעומת זאת, המושבה ויוצרים מבחני הוכיחה את קיומו של oligopotent Gmp (אבות נויטרופילים וגם מונוציט פוטנציאליים)1,שבר “GMP”2, זה נתמך על ידי תא בודד לאחרונה ניתוח transcriptomic8. לא כיום ידוע, עם זאת, בין אם אלה Gmp oligopotent גם לייצר אחרים גרנולוציטים (אאוזינופילים, בזופילים, ו תאי פיטום).
בהתבסס על מחקרים אלה, עכשיו נדגים איך פני השטח 7 סמנים (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C ו CD115) יכול לשמש לזיהוי ולבידוד אלה 6 קבוצות משנה של oligopotent, ביצע לשושלת אבות מיאלואידית. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מיושם עבור in vitro לקשרי תרבות מבחני (תרבויות methylcellulose או נוזל), ויוו העברה המאמצת ניסויים עכברים, אנליזה מולקולרית (רצפי RNA בתפזורת, תא בודד, סופג המערבי, וכו).
הפרוטוקול מורכב 3 שלבים: 1) הכנת השעיה תא בודד של מח העצם תאים, 2) העשרה עבור אבות hematopoietic (מגנטי תא לפעיל על-מיון), ו- 3) זיהוי ובידוד במידת הצורך, של קבוצות משנה קדמון על ידי זרימת cytometry (באמצעות מנתח או סדרן, לפי הצורך). הצעד הראשון הוא בידודו של תאים במח העצם עצמות הירך ואת tibias של עכברים לאללה, והוא דומה לזה שתואר לעיל פרוטוקולים אחרים9. בשלב הבא, המדגם הוא מועשר עבור תאי גזע וקדמון באמצעות קוקטייל של נוגדנים נגד סמני פני שטח התא של אריתרוציטים, נויטרופילים ומונוציטים, לימפוציטים, וכו ‘, כדי לרוקן את התאים הבדיל. זו אינה חובה, אבל מומלץ בחום כדי למטב את הזיהוי של ערכות המשנה קדמון, וכדי להפחית את כמות נוגדנים לצורך זיהוי קדמון ולא את הזמן הנדרש עבור cytometry זרימה. פרוטוקול דלדול שושלת היוחסין להלן מתאר מיון תא Magnetic-Activated (מקינטוש) באמצעות ערכת דלדול העכבר תא השושלת (אשר מכיל biotinylated נוגדנים נגד CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/ג), 7-4, וטר-119, בנוסף אנטי ביוטין . גרגרי) ומפריד ממוכנת מגנטי. השלב האחרון הוא הזיהוי (ומיון, במידת הצורך) של ערכות המשנה קדמון על ידי cytometry זרימה. לוח נוגדן המתוארים להלן (ראה גם לוח 1) תוכנן כדי לשמש cytometer זרימה (מנתח או סדרן) עם לייזרים 4 (405 ננומטר, 488 ננומטר, 561 nm, 640 ננומטר).
איור 1: אבות נויטרופילים, מונוציט, DC מסלולים בידול. המודל לאחרונה המתוקן של myelopoiesis7 מודגם, עם השערים וייסמן “CMPs” (כחול) ו- “Gmp” (ירוק)1 בשכבות. איור זה השתנה. ואח 2017 Yáñez7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Protocol
Representative Results
Discussion
ויסמן gating אסטרטגיה עבור זיהוי קדמון מיאלואידית העכבר1 כבר את תקן זהב עבור immunologists ו ההמטולוגים במשך כמעט 20 שנה, אבל עכשיו זה לכאורה כי השערים “CMP” ו- “GMP” הם מאוד הטרוגנית יותר מדויק אסטרטגיות המגביל נחוצים. בפרוטוקול כי שתיארנו כאן מאפשר הזיהוי של oligopotent ושל קבוצות משנה ביצע שושל?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרוטוקול זה פותחה באמצעות קרנות ממכון לוח של המושלים הרגנרציה לרפואה במרכז הרפואי Cedars-Sinai (כדי HSG), קריירות ב מלגת אימונולוגיה של האגודה האמריקאית של Immunologists (כדי AY HSG), ו פרס מלומד האגודה האמריקנית של המטולוגיה (כדי AY). אנו מודים הליבה Cytometry זרימה בבית Cedars-Sinai Medical Center על סיוע עם FACS מיון.
Materials
| Mouse: Wild-type C57BL/6J (CD45.2) | The Jackson Laboratories | Cat#JAX:000664 | |
| Lineage Cell Depletion Kit, mouse | Miltenyi Biotec | Cat#130-090-858 | |
| Rat anti-mouse CD34 (clone RAM34) FITC | BD Biosciences | Cat#553733 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 (FcγR; clone 93) APC-Cy7 | BioLegend | Cat#101327 | |
| Rat anti-mouse Ly6A/E (Sca-1; clone 108113) PE-Cy7 | BioLegend | Cat#108114 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-Kit; clone 2B8) Pacific Blue | BioLegend | Cat#105820 | |
| Rat anti-mouse Ly6C (clone HK1.4) PerCP-Cy5.5 | BioLegend | Cat#128012 | |
| Rat anti-mouse CD115 (clone AFS98) PE | BioLegend | Cat#135506 | |
| Rat anti-mouse CD135 (Flt3; clone A2F10.1) APC | BD Biosciences | Cat#560718 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Thermo Fisher Scientific | Cat#C36950 | |
| AutoMACS Separator | Miltenyi Biotec | N/A | Use the "deplete" program |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 15 colors |
| BD FACS Aria III cell sorter | BD Biosciences | N/A | 5 lasers, 13 colors |
| FlowJo | FlowJo, LLC | https://www.flowjo.com | For further analysis of the .fcs files |
Riferimenti
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).
- Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production. Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311 (5757), 83-87 (2006).
- Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).
- Yáñez, A., et al. Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes. Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).
- Olsson, A., et al. Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice. Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).
- Yáñez, A., Goodridge, H. S. Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production. Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
