Uma alta produtividade, alto teor, baseada em líquido c. elegans patossistema
Summary
Aqui descrevemos um protocolo que é um anfitrião inteiro, adaptável, ferramenta de triagem de alto teor que pode ser utilizada para estudar interações patógeno-hospedeiro e ser usado para a descoberta de medicamentos.
Abstract
O número de novas drogas identificado pelo tradicional, telas em vitro tem diminuído, reduzindo o sucesso desta abordagem na busca de novas armas combater a resistência a múltiplas drogas. Isto levou à conclusão de que pesquisadores não só a necessidade de encontrar novas drogas, mas também precisam desenvolver novas formas de encontrá-los. Entre o candidato mais promissor métodos são todo-organismo, in vivo , os ensaios que uso elevado-throughput, fenotípicas leituras e hospeda que variam entre Caenorhabditis elegans Danio rerio. Esses hosts têm várias vantagens poderosas, incluindo grandes reduções no falsos positivos hits, como compostos que são tóxicos para o anfitrião e/ou biounavailable são tipicamente caiu na tela inicial, antes de seguir caro acima.
Aqui nós mostramos como nosso ensaio tem sido usado para interrogar a variação do anfitrião na bem documentada c. elegans— patossistema líquido da matança dePseudomonas aeruginosa . Também demonstramos várias extensões desta técnica bem trabalhado para fora. Por exemplo, somos capazes de realizar elevado-throughput genéticas telas usando RNAi em 24 – ou 96 poços placa formatos de fatores do hospedeiro consulta nessa interação patógeno-hospedeiro. Usando este ensaio, telas de genoma inteiro podem ser concluídas em poucos meses, que drasticamente podem simplificar a tarefa de identificar alvos de drogas, potencialmente sem a necessidade de abordagens de purificação bioquímica laborioso.
Também relatamos aqui uma variação do nosso método que substitui a Gram-positive bactéria Enterococcus faecalis para o patógeno gram-negativa p. aeruginosa. Muito, como é o caso de p. aeruginosa, matar por E. faecalis é dependente do tempo. Ao contrário do anterior c. elegans— ensaios deE. faecalis , nosso ensaio de E. faecalis não precisam preinfection, melhorar seu perfil de segurança e reduzindo as chances de contaminar o equipamento de tratamento de líquido. O ensaio é altamente robusto, apresentando infecção de post ~ 95% taxas de morte 96 h.
Introduction
A identificação e o desenvolvimento de antibióticos de amplo espectro, eficazes, agora quase um século atrás, levaram a um momento decisivo na saúde pública onde havia uma crença generalizada que infecciosa doença seria um flagelo do passado. Dentro de poucas décadas, esse otimismo começou a diminuir, como patógeno após patógeno desenvolver mecanismos de resistência que limitado a esses tratamentos uma vez milagrosos. Há algum tempo, a corrida armamentista entre os esforços de descoberta de drogas e os patógenos parecia equilibrada. No entanto, o abuso de antimicrobianos recentemente culminou no surgimento de cepas de Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Serratia marcescense p. aeruginosa1, pandrogas resistentes 2,3,4.
P. aeruginosa é um oportunista, gram negativos, vários hosts patógeno que é uma ameaça grave para os pacientes com queimaduras graves, aqueles que estão imunocomprometidos, ou tem fibrose cística. É também cada vez mais identificado como um agente causador de infecções nosocomiais graves, particularmente devido a sua aquisição em curso de resistência aos antimicrobianos. Para começar, para enfrentar esta ameaça, nós usamos o bem-documentado c. elegans–p. aeruginosa infecção sistema5. Nosso laboratório tem aproveitado este sistema para desenvolver uma plataforma baseada em líquido, alta produtividade, alto teor de rastreio para identificar novos compostos que limitam a capacidade do patógeno para matar o anfitrião6. Curiosamente, estes compostos parecem pertencer pelo menos três categorias gerais, incluindo antimicrobianos7 e virulência inibidores8. Outros ensaios de descoberta de drogas de alto teor em c. elegans foram relatados para Mycobacterium tuberculosum, Chlamydia trachomatis, Yersinia pestis, Listeria monocytogenes, Francisella tularensis, Staphylococcus aureus, Candida albicans, e Enterococcus faecalis, entre outros9,10,11,12,13,14,15,16. Esses tipos de ensaios têm várias vantagens bem reconhecidas, como falsos positivos sucessos que podem ser tóxicos para o host e o patógeno, aumento da probabilidade de biodisponibilidade em comparação com uma tela de química e a capacidade de identificar sucessos além de limitar simplesmente limitar o crescimento microbiano, como anti-virulents, imunes estimulatórios moléculas ou compostos que caso contrário inclinar o equilíbrio da interação patógeno-hospedeiro em favor do antigo. Além disso, os compostos descobertos nessas telas são frequentemente eficazes em hospedeiros mamíferos.
É interessante notar que pelo menos dois outros ensaios17,18 estão disponíveis para realizar em telas de alta produtividade em c. elegans em líquido. No entanto, cada um destes ensaios é uma modificação que permite o ensaio de colonização intestinal protótipo, conhecido como lento-matança, a realizar-se em líquido, aumentando o throughput e permitindo compostos mais prontamente ser projectado. Caracterização cuidadosa demonstrou conclusivamente que os mecanismos de virulência bacteriana são diferentes entre estes ensaios e nossa tela baseada em líquido7. Desde que ambos os tipos de virulência são observados nos sistemas dos mamíferos, é importante considerar quais determinantes de virulência são mais relevante para os interesses do experimentador antes da seleção do ensaio.
Aqui demonstramos uma versão otimizada do líquido-baseado ensaio c. elegans-P. aeruginosa . Também relatamos a adaptação do nosso método de ensaio de líquido-baseado para acomodar o patógeno bacteriano Gram-positiva Enterococcus faecalis. Como p. aeruginosa, E. faecalis é identificado cada vez mais como uma ameaça séria nosocomial com um armamento crescente de resistência antimicrobiana vias1. Embora um método anterior de seleção da elevado-produção de E. faecalis existe14, exige preinfection com o patógeno, o que complica o processo e aumenta a probabilidade de contaminação de equipamentos como o FlowSort COPAS. Nosso protocolo elimina a necessidade de pre-infecção, melhorando o perfil de segurança. Finalmente, nós relatamos um meio pelo qual um destes ensaios podem ser combinado com alimentação RNAi, permitindo que o usuário Pesquisar por fatores do hospedeiro que desempenham um papel no estabelecimento de, ou resistência à infecção.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este ensaio (ou ensaios semelhantes onde outros agentes patogénicos são substituídos por p. aeruginosa ou E. faecalis) são útil para uma variedade de finalidades, incluindo a descoberta de medicamentos. Também é útil para abordar questões biológicas fundamentais, tais como a identificação de fatores de virulência, a elucidação das vias de defesa do hospedeiro e determinando as máquinas reguladoras envolvidas na interação patógeno-hospedeiro.
Embora o ensaio…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado pela prevenção do câncer e Instituto de pesquisa de Texas (CPRIT) prêmio RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930 e pelo nacional institutos de saúde K22 AI110552 atribuído a NVK. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| COPAS FP BioSorter | Union Biometrica | Large object flow cytometer/worm sorter | |
| Cytation 5 | BioTek | ||
| EL406 Washer Dispenser | BioTek | ||
| Multitron Pro | Infors HT | ||
| 24 Deep-Well RB Block | Thermo Fisher Scientific | CS15124 | |
| 384-Well plate | Greiner Bio-One | MPG-781091 | |
| Nematode Growth Media (NGM) | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 2.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) plates | Amount per liter: 18 grams agar, 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Slow Killing (SK) media | Amount per liter: 3 grams NaCl, 3.5 grams Peptone, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phosphate buffer, and 973 mL of milli-Q water | ||
| Lysogeny Broth (LB) | USBiological Life Sciences | L1520 | |
| Brian Heart Infusion broth (BHI) | Research Products International Corp | 50-488-526 | |
| Worm Bleach Solution | Amount per 100 mL: 10 mL of 5 M NaOH solution, 20 mL of 5% Sodium Hypochlorite Solution, and 70 mL of sterile water | ||
| S Basal | Amount per liter: 5.85 grams NaCl, 6 grams KH2PO4, 1 gram K2HPO4, and 1 Liter of milli-Q water | ||
| Agar | USBiological Life Sciences | A0930 | |
| NaCl | USBiological Life Sciences | S5000 | |
| Peptone | USBiological Life Sciences | P3300 | |
| CaCl2 | USBiological Life Sciences | ||
| MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Phospate buffer | amount per liter: 132 mL of K2HPO4 (1M) and 868 mL of KH2PO4 (1M) | ||
| KH2PO4 | Acros Organics | 7778-77-0 | |
| K2HPO4 | USBiological Life Sciences | P5100 | |
| 5% Sodium Hypochlorite Solution | BICCA | 7495.5-32 | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Breathe-easy | Diversified Biotech | BEM-1 | |
| SYTOX Orange Nucleic Acid Stain | Fisher Scientific | S11368 | |
| Bacterial Strains | |||
| P. aeruginosa (PA14) | |||
| E. faecalis(OG1RF) | |||
| E. coli superfood (OP50) | |||
| E. coli RNAi expressing bacteria (HT115) | |||
| Worm Strains | |||
| glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064) | |||
| PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717) |
Riferimenti
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