Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental
Summary
Este protocolo descreve a transiente engenharia genética de células-tronco dentárias extraídas do folículo dental humano. A estratégia de modificação não-virais aplicada pode tornar-se uma base para a melhoria dos produtos terapêuticos células-tronco.
Abstract
Até à data, vários tipos de células-tronco em diferentes estádios de desenvolvimento estão no foco para o tratamento de doenças degenerativas. Ainda, certos aspectos, tais como morte celular maciça inicial e baixos efeitos terapêuticos, prejudicada sua ampla tradução clínica. Engenharia genética de células-tronco antes da transplantação surgiu como um método promissor para otimizar os efeitos terapêuticos de células estaminais. No entanto, sistemas de entrega segura e eficiente do gene ainda estão faltando. Portanto, o desenvolvimento de métodos adequados pode fornecer uma abordagem para resolver desafios atuais de terapias baseadas em células-tronco.
O presente protocolo descreve o extração e caracterização de células-tronco humanas folículo dental (hDFSCs) bem como suas modificações genéticas não-virais. O folículo dental pós-natal revelou-se como uma fonte promissora e facilmente acessível para a colheita de células estaminais adultas multipotentes possuindo potencial de alta proliferação. O procedimento de isolamento descrito apresenta um método simples e confiável para colher hDFSCs de dentes do siso. Este protocolo inclui também métodos para definir as características de células-tronco de células isoladas. Para a engenharia genética de hDFSCs, uma estratégia otimizada do transfection baseada em lipídios catiônicos é apresentada permitindo introdução de microRNA altamente eficiente sem causar efeitos citotóxicos. MicroRNAs são candidatos adequados para manipulação de célula transitória, como estes pequenos reguladores translacionais controlam o destino e comportamento de células-tronco sem o perigo de integração estável do genoma. Assim, este protocolo representa um procedimento seguro e eficiente para a engenharia de hDFSCs que pode se tornar importante para otimizar sua eficácia terapêutica.
Introduction
O folículo dental humano é um frouxo ectomesenchymally-derivado do tecido conjuntivo em torno do desenvolvimento dente1,2. Ao lado de sua função de coordenação osteoclastogenesis e osteogênese para o processo de erupção do dente, este tecido abriga células estaminais e progenitoras especialmente para o desenvolvimento do periodonto,4,3,5. Portanto, o folículo dental é considerado como uma fonte alternativa para colher células-tronco adultas humanas6,7.
Vários estudos demonstraram que as células-tronco humanas folículo dental (hDFSCs) são capazes de diferenciar em linhagem periodontal, incluindo osteoblastos, fibroblastos do ligamento e cementoblastos8,9,10 . Além disso, essas células foram mostradas para coincidir com todas as características de células estromais mesenquimais (MSCs) incluindo a capacidade de auto renovadora, aderência plástica, expressão de marcadores de superfície específicas (por exemplo,, CD73, CD90, CD105), bem como osteogênico, adipogenic e chondrogenic diferenciação potencial11,12,13. Outros estudos também revelaram um potencial de diferenciação neural de hDFSCs2,14,15,16,17,18.
Devido a suas propriedades promissoras e fácil acesso, o hDFSCs tornou-se recentemente relevante para a engenharia de tecido19,20,21. Os primeiros estudos concentraram-se sobre o potencial de DFSCs de regeneração óssea, periodontal e raízes de dente19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Desde o conhecimento da funcionalidade de neurogênica de hDFSCs, sua aplicação como potencial tratamento para doenças neurodegenerativas tem sido investigados31,32,33. HDFSCs também ganharam importância com respeito à regeneração de outros tecidos (por exemplo, o epitélio corneano)34,35. O potencial terapêutico de hDFSC não se baseia apenas em seu potencial de diferenciação directa, mas também na sua atividade parácrina. Recentemente, hDFSCs têm sido mostrados para secretar uma variedade de fatores bioativos, tais como metaloproteinases de matriz (MMPs), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF) e crescimento hepatócito fator (HGF), que desempenham um papel crucial para a angiogênese, imunomodulação, remodelação da matriz extracelular e processos reparativa36.
No entanto, ampla tradução clínica da terapia de células-tronco ainda é prejudicada por vários desafios, como a morte maciça inicial celular e células-tronco baixo benéfico efeitos37,38. Engenharia genética fornece uma estratégia promissora para enfrentar esses desafios e, portanto, pode aumentar consideravelmente a eficácia terapêutica de células-tronco38,39,40. Para manipulação de célula transitória, microRNAs (miRs) são candidatos adequados, como estes pequenos reguladores translacionais controlam o destino e comportamento de células-tronco sem o perigo de genoma estável integração41,42, 43. até à data, vários miRs benéficos foram identificados promovendo a proliferação de células-tronco, sobrevivência, orientação, atividade parácrina bem como a sua diferenciação em várias linhagens44. Por exemplo, miR-133a engenharia MSCs mostrou uma maior sobrevivência e enxertia em corações de rato enfartado, resultando em uma melhor função cardíaca quando comparado a não modificado MSCs45. Da mesma forma, miR-146 superexpressão MSCs foram mostrados a secretar quantidades mais elevadas de VEGF, que por sua vez, levou a uma maior eficiência terapêutica no tecido isquêmico46.
Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a extração seletiva e engenharia genética de hDFSCs. Para este fim, descrevemos a digestão enzimática e colheita dos folículos dentários humanas, bem como o posterior isolamento do hDFSCs. Para caracterizar células isoladas, instruções importantes para a verificação das propriedades MSC foram incluídas em conformidade com as diretrizes da sociedade internacional para terapia celular13. Além disso, nós fornecemos uma descrição detalhada para a geração de hDFSCs miR-modificado pela aplicação de uma estratégia de transfeccao baseada em lipídios catiônicos e a avaliação da eficiência do transfection e citotoxicidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Células-tronco adultas estão atualmente em foco para o tratamento de diversas doenças degenerativas. Em particular, a medula (BM) óssea-derivadas de células-tronco, incluindo as células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) e MSCs, estão sob investigação clínica intensiva47. No entanto, BM colheita é um procedimento invasivo, causando dor no local da doação e pode levar a efeitos adversos48. Recentemente, o tecido dental pós-Natal tem emergido como um romance …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo programa Forum de Rostock University Medical Centre (889018) e a Fundação úmida (2016-11). Além disso, P.M. e R.D. são suportados pelo BMBF (VIP + 00240).
Materials
| Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA1557A488 | Clone SN6, monoclonal |
| Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488 | Bio-Rad | MCA928A488 | monoclonal |
| APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody | BD Biosciences | 559883 | Clone MAR4, monoclonal |
| APC Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555751 | Clone MOPC-21, monoclonal |
| PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody | BD Biosciences | 550257 | Clone AD2, monoclonal |
| PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 555749 | Clone MOPC-21, monoclonal |
| PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody | BD Biosciences | 339217 | Clone 104D2, monoclonal |
| PE-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 557872 | Clone MOPC-21, monoclonal |
| PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody | BD Biosciences | 560531 | Clone G44-26, monoclonal |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 558304 | Clone 27-35, monoclonal |
| PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90 Antibody | BD Biosciences | 561557 | Clone 5E10, monoclonal |
| PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 55095 | Clone MOPC-21, monoclonal |
| V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody | BD Biosciences | 560777 | Clone HI30, monoclonal |
| V500 Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody | BD Biosciences | 560787 | Clone X40, monoclonal |
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-020 | 0.5M, pH 8.0 |
| Steritop | Merck Millipore | SCGPT05RE | 0.22 µm, radio-sterilized, polyethersulfone |
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PFA | Merck Millipore | 1040051000 | |
| Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit | R&D Systems | SC006 | |
| RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17120 | 5 nmol |
| Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Thermo Fisher Scientific | AM17110 | 5nmol |
| Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | polyclonal |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | polyclonal |
| Mounting medium; Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | histology mounting medium |
| ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Zeiss | ||
| BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
| ZEN2011 software | Zeiss | ||
| Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%) | Biochrom | L2143 | in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+ |
| Amine reactive dye; LIVE/DEAD™ Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| PBS (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | pH: 7.4; w/o: Ca and Mg |
| P-S-G (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Basal medium; Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11039021 | |
| Antibiotic, ZellShield | Biochrom | W 13-0050 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| Collagenase type I | Thermo Fisher Scientific | 17100017 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Filter, Sterifix syringe filter 0.2 µm | Braun | 4099206 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,547,254 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Sarstedt | 833,910,002 | |
| Cell culture flask, 25 cm2 | Sarstedt | 833,911,002 | |
| Freezing medium, Biofreeze | Biochrom | F 2270 | |
| Cryotubes | Thermo Fisher Scientific | 377267 | 1.8 mL |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4 % |
| Counting chamber | Paul Marienfeld | ||
| Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001% | Mibe | ||
| NaCl solution | Braun | 0.9 % | |
| Vicryl satures, Vicryl rapide | Ethicon | 3 – 0 |
Riferimenti
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: Applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839-851 (2015).
- Lima, R. L., et al. Human dental follicle cells express embryonic, mesenchymal and neural stem cells markers. Archives of oral biology. 73, 121-128 (2017).
- Wise, G. E. Cellular and molecular basis of tooth eruption. Orthodontics & craniofacial research. 12 (2), 67-73 (2009).
- Baykul, T., Saglam, A. A., Aydin, U., Başak, K. Incidence of cystic changes in radiographically normal impacted lower third molar follicles. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 99 (5), 542-545 (2005).
- Wise, G. E., Frazier-Bowers, S., D’Souza, R. N. Cellular, molecular, and genetic determinants of tooth eruption. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists. 13 (4), 323-334 (2002).
- Ten Cate, A. R. The development of the periodontium: A largely ectomesenchymally derived unit. Periodontology 2000. 13 (1), 9-19 (1997).
- Park, B. -. W., et al. In vitro and in vivo osteogenesis of human mesenchymal stem cells derived from skin, bone marrow and dental follicle tissues. Differentiation; research in biological diversity. 83 (5), 249-259 (2012).
- Sowmya, S., et al. Periodontal Specific Differentiation of Dental Follicle Stem Cells into Osteoblast, Fibroblast, and Cementoblast. Tissue engineering. Part C, Methods. 21 (10), 1044-1058 (2015).
- Kémoun, P., et al. Human dental follicle cells acquire cementoblast features under stimulation by BMP-2/-7 and enamel matrix derivatives (EMD) in vitro. Cell and tissue research. 329 (2), 283-294 (2007).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Hieke, C., et al. Human dental stem cells suppress PMN activity after infection with the periodontopathogens Prevotella intermedia and Tannerella forsythia. Scientific reports. 6, 39096 (2016).
- Kumar, A., et al. Molecular spectrum of secretome regulates the relative hepatogenic potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and dental tissue. Scientific reports. 7 (1), 15015 (2017).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Ullah, I., et al. In vitro comparative analysis of human dental stem cells from a single donor and its neuronal differentiation potential evaluated by electrophysiology. Life sciences. 154, 39-51 (2016).
- Völlner, F., Ernst, W., Driemel, O., Morsczeck, C. A two-step strategy for neuronal differentiation in vitro of human dental follicle cells. Differentiation; research in biological diversity. 77 (5), 433-441 (2009).
- Morsczeck, C., et al. Comparison of human dental follicle cells (DFCs) and stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) after neural differentiation in vitro. Clinical oral investigations. 14 (4), 433-440 (2010).
- Kadar, K., et al. Differentiation potential of stem cells from human dental origin – promise for tissue engineering. Journal of physiology and pharmacology: An official journal of the Polish Physiological Society. 60, 167-175 (2009).
- Heng, B. C., et al. Decellularized Matrix Derived from Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells Enhances the Neurogenic Potential of Dental Follicle Stem Cells. Journal of endodontics. 43 (3), 409-416 (2017).
- Honda, M. J., Imaizumi, M., Tsuchiya, S., Morsczeck, C. Dental follicle stem cells and tissue engineering. Journal of Oral Science. 52 (4), 541-552 (2010).
- Liu, J., et al. Concise reviews: Characteristics and potential applications of human dental tissue-derived mesenchymal stem cells. Stem cells. 33 (3), 627-638 (2015).
- Morsczeck, C., Reichert, T. E. Dental stem cells in tooth regeneration and repair in the future. Expert opinion on biological therapy. 18 (2), 187-196 (2018).
- Rezai-Rad, M., et al. Evaluation of bone regeneration potential of dental follicle stem cells for treatment of craniofacial defects. Cytotherapy. 17 (11), 1572-1581 (2015).
- Handa, K., et al. Progenitor Cells From Dental Follicle Are Able to Form Cementum Matrix In Vivo. Connective Tissue Research. (2-3), 406-408 (2009).
- Tsuchiya, S., Ohshima, S., Yamakoshi, Y., Simmer, J. P., Honda, M. J. Osteogenic Differentiation Capacity of Porcine Dental Follicle Progenitor Cells. Connective Tissue Research. 51 (3), 197-207 (2010).
- Honda, M. J., et al. Stem cells isolated from human dental follicles have osteogenic potential. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics. 111 (6), 700-708 (2011).
- Guo, W., et al. Dental follicle cells and treated dentin matrix scaffold for tissue engineering the tooth root. Biomaterials. 33 (5), 1291-1302 (2012).
- Yang, B., et al. Tooth root regeneration using dental follicle cell sheets in combination with a dentin matrix – based scaffold. Biomaterials. 33 (8), 2449-2461 (2012).
- Bai, Y., et al. Cementum- and periodontal ligament-like tissue formation by dental follicle cell sheets co-cultured with Hertwig’s epithelial root sheath cells. Bone. 48 (6), 1417-1426 (2011).
- Guo, S., et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration. Cell transplantation. 22 (6), 1061-1073 (2013).
- Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC biotechnology. 15, 114 (2015).
- Li, X., et al. A therapeutic strategy for spinal cord defect: Human dental follicle cells combined with aligned PCL/PLGA electrospun material. BioMed research international. , 197183 (2015).
- Yang, C., Li, X., Sun, L., Guo, W., Tian, W. Potential of human dental stem cells in repairing the complete transection of rat spinal cord. Journal of neural engineering. 14 (2), 26005 (2017).
- Kanao, S., et al. Capacity of Human Dental Follicle Cells to Differentiate into Neural Cells In Vitro. Stem Cells International. 2017, 8371326 (2017).
- Sung, I. -. Y., et al. Cardiomyogenic Differentiation of Human Dental Follicle-derived Stem Cells by Suberoylanilide Hydroxamic Acid and Their In Vivo Homing Property. International journal of medical sciences. 13 (11), 841-852 (2016).
- Botelho, J., Cavacas, M. A., Machado, V., Mendes, J. J. Dental stem cells: Recent progresses in tissue engineering and regenerative medicine. Annals of medicine. 49 (8), 644-651 (2017).
- Dou, L., et al. Secretome profiles of immortalized dental follicle cells using iTRAQ-based proteomic analysis. Scientific reports. 7 (1), 7300 (2017).
- Lee, S., Choi, E., Cha, M. -. J., Hwang, K. -. C. Cell adhesion and long-term survival of transplanted mesenchymal stem cells: A prerequisite for cell therapy. Oxidative medicine and cellular longevity. 2015, 632902 (2015).
- Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Recent Progress in Stem Cell Modification for Cardiac Regeneration. Stem Cells International. 2018 (2), 1-22 (2018).
- Nowakowski, A., Walczak, P., Janowski, M., Lukomska, B. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells for Regenerative Medicine. Stem cells and development. 24 (19), 2219-2242 (2015).
- Nowakowski, A., Walczak, P., Lukomska, B., Janowski, M. Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells to Induce Their Migration and Survival. Stem Cells International. 2016, 4956063 (2016).
- Gulluoglu, S., Tuysuz, E. C., Bayrak, O. F., #350;ahin, F., Doğan, A., Demirci, S. miRNA Regulation in Dental Stem Cells: From Development to Terminal Differentiation. Dental Stem Cells. Stem Cell Biology and Regenerative Medicine. , (2016).
- Hammond, S. M. An overview of microRNAs. Advanced drug delivery reviews. 87, 3-14 (2015).
- Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular research. 93 (4), 614-622 (2012).
- Clark, E. A., Kalomoiris, S., Nolta, J. A., Fierro, F. A. Concise Review: MicroRNA Function in Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. Stem cells. 32 (5), 1074-1082 (2014).
- Dakhlallah, D., et al. MicroRNA-133a engineered mesenchymal stem cells augment cardiac function and cell survival in the infarct heart. Journal of cardiovascular pharmacology. 65 (3), 241-251 (2015).
- Seo, H. -. H., et al. Exogenous miRNA-146a Enhances the Therapeutic Efficacy of Human Mesenchymal Stem Cells by Increasing Vascular Endothelial Growth Factor Secretion in the Ischemia/Reperfusion-Injured Heart. Journal of vascular research. 54 (2), 100-108 (2017).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell stem cell. 17 (1), 11-22 (2015).
- Siddiq, S., et al. Bone marrow harvest versus peripheral stem cell collection for haemopoietic stem cell donation in healthy donors. The Cochrane database of systematic reviews. (1), CD006406 (2009).
- Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Andrades, J. A. Dental-Related Stem Cells and Their Potential in Regenerative Medicine. Regenerative Medicine and Tissue Engineering. , (2013).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Honda, M. J., et al. Side population cells expressing ABCG2 in human adult dental pulp tissue. International endodontic journal. 40 (12), 949-958 (2007).
- Seo, B. -. M., et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament. The Lancet. 364 (9429), 149-155 (2004).
- Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
- Sonoyama, W., et al. Characterization of the apical papilla and its residing stem cells from human immature permanent teeth: a pilot study. Journal of endodontics. 34 (2), 166-171 (2008).
- Nollet, E., Hoymans, V. Y., van Craenenbroeck, A. H., Vrints, C. J., van Craenenbroeck, E. M. Improving stem cell therapy in cardiovascular diseases: the potential role of microRNA. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 311 (1), H207-H218 (2016).
- Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
- Schade, A., et al. Magnetic Nanoparticle Based Nonviral MicroRNA Delivery into Freshly Isolated CD105(+) hMSCs. Stem cells international. 2014, 197154 (2014).
- Bulbake, U., Doppalapudi, S., Kommineni, N., Khan, W. Liposomal Formulations in Clinical Use: An Updated Review. Pharmaceutics. 9 (2), (2017).
- Xue, H. Y., Liu, S., Wong, H. L. Nanotoxicity: a key obstacle to clinical translation of siRNA-based nanomedicine. Nanomedicine. 9 (2), 295-312 (2014).
- Nguyen, L. T., Atobe, K., Barichello, J. M., Ishida, T., Kiwada, H. Complex formation with plasmid DNA increases the cytotoxicity of cationic liposomes. Biological & pharmaceutical bulletin. 30 (4), 751-757 (2007).
- Omidi, Y., Barar, J., Akhtar, S. Toxicogenomics of cationic lipid-based vectors for gene therapy: impact of microarray technology. Current drug delivery. 2 (4), 429-441 (2005).
- Hausburg, F., et al. Defining optimized properties of modified mRNA to enhance virus- and DNA- independent protein expression in adult stem cells and fibroblasts. Cellular physiology and biochemistry: International journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 35 (4), 1360-1371 (2015).
- Cardarelli, F., et al. The intracellular trafficking mechanism of Lipofectamine-based transfection reagents and its implication for gene delivery. Scientific reports. 6, 25879 (2016).
- Kirschman, J. L., et al. Characterizing exogenous mRNA delivery, trafficking, cytoplasmic release and RNA-protein correlations at the level of single cells. Nucleic acids research. 45 (12), e113 (2017).
- Li, L., Nie, Y., Ye, D., Cai, G. An easy protocol for on-chip transfection of COS-7 cells with a cationic lipid-based reagent. Lab on a chip. 9 (15), 2230-2233 (2009).
- Chang, K., Marran, K., Valentine, A., Hannon, G. J. RNAi in cultured mammalian cells using synthetic siRNAs. Cold Spring Harbor protocols. 2012 (9), 957-961 (2012).
- Sakurai, K., Chomchan, P., Rossi, J. J. Silencing of gene expression in cultured cells using small interfering RNAs. Current protocols in cell biology. , (2010).
- Hoelters, J., et al. Nonviral genetic modification mediates effective transgene expression and functional RNA interference in human mesenchymal stem cells. The journal of gene medicine. 7 (6), 718-728 (2005).
