Følsomme måling af Mitophagy ved Flow flowcytometri ved hjælp af pH-afhængige fluorescerende Reporter mt-Keima

Summary

Mitophagy, selektiv nedbrydningen af mitokondrier, har været impliceret i mitokondrie homøostase og er liberaliseret i forskellige sygdomme hos mennesker. Praktisk eksperimentelle metoder til at måle mitophagy aktiviteten er imidlertid meget begrænset. Her, leverer vi en følsom analyse til måling af mitophagy aktivitet ved hjælp af flowcytometri.

Abstract

Mitophagy er en proces i selektiv fjernelse af beskadigede eller unødvendige mitokondrier ved hjælp af autophagy maskiner. Tætte forbindelser har fundet mellem defekte mitophagy og forskellige sygdomme hos mennesker, herunder neurodegenerative sygdomme, kræft og metaboliske sygdomme. Derudover har nylige undersøgelser vist, at mitophagy er involveret i normal cellulære processer, såsom differentiering og udvikling. Men den præcise rolle og molekylære mekanismer bag mitophagy kræver yderligere undersøgelse. Derfor er det kritisk at udvikle en robust og praktisk metode til at måle ændringer i mitophagy aktivitet. Her beskriver vi en detaljeret protokol til kvantitativt mitophagy virksomhed gennem flowcytometri ved hjælp af mitokondrier-målrettet fluorescerende protein Keima (mt-Keima). Dette flow flowcytometri assay kan analysere mitophagy aktivitet mere hurtigt og fornuftigt end konventionelle mikroskopi – eller immunoblotting-baserede metoder. Denne protokol kan anvendes til at analysere mitophagy aktivitet i forskellige celletyper.

Introduction

Mitokondrier er organelles, der er nødvendige for celledelingen og fysiologi. Mitokondrier er ansvarlig for at generere mere end 80% af ATP levering via oxidativ fosforylering, og de giver også forskellige metaboliske mellemprodukter til biosyntese og metabolisme^1,2. Ud over deres rolle i energiforsyningen og metabolisme spille mitokondrier centrale roller i mange andre vigtige processer, herunder reaktive ilt arter (ROS) generation, regulering af celledød og intracellulære Ca^{2 +} dynamics³ . Ændringer i mitokondrie-funktion er blevet forbundet med menneskelige sygdomme, herunder kræft, diabetes mellitus og forskellige neurodegenerative sygdomme^4,5. Øget mitokondriel dysfunktion og mitokondriel DNA mutationer er også menes at bidrage til normal aldring processer^6,7,8. Kvalitetskontrol er derfor et afgørende spørgsmål i mitokondrierne. Mitokondrier er yderst dynamisk organelles, der løbende kan ændre deres form mellem aflange netværk og korte, fragmenterede form. Mitokondrier dynamics spiller en vigtig rolle i at bevare funktionen af mitokondrier samt deres nedbrydning gennem mitophagy⁹.

Mitophagy er en mekanisme, der involverer den selektive nedbrydning af hele mitokondrier ved hjælp af autophagy maskiner. Mitophagy er principielt mekanisme underliggende mitokondrie omsætning og fjernelse af beskadigede eller dysfunktionelle mitochondrier. I denne proces, er mitokondrier først omgivet af en membran, som resulterer i dannelsen af autophagosomes, som derefter fusionere med lysosomer for hydrolytisk nedbrydning⁹. Tidligere genetiske undersøgelser i Drosophila har antydet, at to Parkinsons sygdom-relaterede gener, PT-induceret formodede kinase 1 (PINK1) (PARK6) og Parkin (PARK2), fungerer i den samme vej^10,11. Delfølge undersøgelser har vist at PINK1-Parkin pathway er ansvarlig for at fjerne beskadigede mitokondrier og mangler i denne pathway resulterer i dårligt fungerende mitophagy og kan bidrage til menneskelige sygdomme^12,13. Defekter i mitophagy processer er for nylig blevet fundet i forskellige menneskelige sygdomme, herunder kræft, hjertesygdomme, leversygdomme og neurodegenerative sygdomme ¹⁴. Derudover har nylige undersøgelser også vist, at mitophagy er afgørende for mange fysiologiske processer, som differentiering, udvikling og immunrespons^{15,16,17,18 ,19}, tyder på, at mitophagy kan spille en mere aktiv rolle i at kontrollere cellefunktioner.

Trods de seneste bekræftelse af, at mitophagy spiller en vigtig rolle i begge kvalitetskontrol i mitokondrierne og sygdom hos mennesker, de molekylære mekanismer bag mitophagy forbliver dårligt forstået. Selv om mitophagy-relaterede mekanismer er blevet systematisk undersøgt i gær, har studier med henblik på at udforske mitophagy-relaterede mekanismer i pattedyrceller primært fokuseret på PINK1-Parkin pathway. Tidligere undersøgelser har godtgjort, at PINK1-Parkin pathway er hovedansvarlig for den selektive fjernelse af beskadiget mitokondrier via mitophagy^12,20,21. Men de seneste undersøgelser har rapporteret, at i nogle modeller kan aktiveres mitophagy selv i mangel af funktionelle PINK1^22,23,24. Disse resultater tyder på, ud over PINK1-Parkin pathway, der en yderligere uidentificerede pathway, der kan aktivere mitophagy.

Fraværet af en praktisk metode til at vurdere mitophagy aktivitet er en væsentlig hindring for at udforske de stier, der regulerer mitophagy og dens rolle i patofysiologiske begivenheder. Elektronmikroskopi er et kraftfuldt værktøj til direkte visualisere autophagosome-opslugte mitokondrier. Elektronmikroskopi har imidlertid begrænsninger i kvantificere mitophagy aktivitet. Selv om strategier, der bruger mikrotubulus-forbundet protein-1 lys kæde 3 (LC3)-konjugeret fluorescerende sonder, som normal god landbrugspraksis-LC3, er i øjeblikket den mest udbredte tilgange²⁵, den forbigående karakter af LC3-baseret signal og dets høje sats af falsk-positive signaler begrænse sin følsomhed for påvisning af mitophagy i cellerne²⁶. En kombination af western blotting for at måle mitokondrie protein niveau, kvantificering af mitokondrie-DNA, og Fluorescens mikroskopi analyse til colocalize mitokondrier med enten autophagosomes eller lysosomer ville være en god tilgang til at vurdere mitophagy. Dog kræver kvantificering begrænsninger og mangel på bekvemmelighed af eksisterende metoder nye tilgange. Indførelsen af en ny pH-afhængige fluorescerende proteiner, mitokondrie målet Keima (mt-Keima), i høj grad forbedret evne til at detektere mitophagy²⁷. Af sammensmeltning af mitokondrie-targeting sekvens af cytokrom c oxidase subunit VIII (COX VIII) i Keima, er mt-Keima rettet mod mitokondriets matrix. De store skift i excitation peak Keima fra 440 nm til 586 nm (svarende til pH 7 og pH 4, henholdsvis) kan udnyttes til at vurdere mitophagy med gode nænsomt i både in vitro- og i vivo eksperimenter^28,29 . Endnu vigtigere, forårsager modstanden i mt-Keima til lysosomale forringelse integration af signalet fra mt-Keima i lysosomer, giver mulighed for nem kvantitativ måling af mitophagy aktivitet. Fluorescens ændringen, der opstår i mt-Keima kan analyseres ved hjælp af enten Konfokal mikroskopi eller flow flowcytometri^28,29. En flow flowcytometri-baserede metode til at måle mitophagy aktiviteten ved hjælp af mt-Keima har imidlertid ikke ydet i detaljer til dato.

Her beskriver vi en detaljeret protokol for en flow flowcytometri-baserede teknik til at måle mitophagy aktiviteten i celler ved hjælp af mt-Keima. Selv om vi har her vist, at analysen af handelsstrømmen flowcytometri held opdaget CCCP-induceret mitophagy i HeLa celler udtrykte parkerin, kan denne teknik anvendes til en lang række celletyper.

Protocol

1. generation af HeLa celler udtrykker mito-Keima (mt-Keima) Forberedelse af mt-Keima lentivirus Coat en 100-mm kultur parabol ved tilsætning 2 mL af 0,001% poly-L-lysin/fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og lad det stå i 5 min ved stuetemperatur. Fjerne den poly-L-lysin løsning ved hjælp af et glas pipette tilsluttet en vacuum og vaske kultur parabol ved tilsætning 2 mL 1 x PBS. Plade 1,5 x 106 HEK293T celler på den coatede kultur fad med 10 m…

Representative Results

Et eksempel på flow flowcytometri analyse af CCCP-induceret mitophagy i HeLa-Parkin celler er vist i figur 4. Ved hjælp af den flow flowcytometri analysemetode, der er beskrevet ovenfor, kan vi opdage en dramatisk stigning i mitophagic celler i den “høje” gate. Procentdelen af celler i den “høje” gate var steget mere end 10-fold sammenlignet med ubehandlet kontrol celler (figur 4A). Denne stigning i mitophagy aktivitet blev h…

Discussion

Vi præsenterer her, en hurtig og følsom metode for at bruge flowcytometri at måle cellulære mitophagy aktivitet i celler, der udtrykker mt-Keima. Celler under en høj grad af mitophagy udviser en øget ratio af PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) excitation. Mitophagy aktivitet kan således udtrykkes som procentdelen af cellerne, udstiller høj 561/405 forholdet. Vi beregnet procentdelen af celler i regionen “høj” gate på en prik plot af PE-CF594 (561 nm) versus BV605 (405 nm), og resultaterne viste, at behandling m…

Materials

REAGENTS
poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
FBS	GIBCO	16000-044
penicillin/streptomycin	wellgene	LS202-02
PBS	Hyclone	SH30013.02
HEK293T	ATCC	CRL-3216
DMEM	GIBCO	12800-082
OPTI-MEM	GIBCO	31985-070
Turbofect	Thermos scientific	R0531
0.45 μm syringe filter	sartorius	16555
HeLa	ATCC	CCL-2
polybrene	Sigma-Aldrich	H9268	8 mg/ml
puromycin	Sigma-Aldrich	P8833	2 mg/ml
Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP)	Sigma-Aldrich	C2759	10 mM
trypsin-EDTA	wellgene	LS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessa	BD Bioscience	LSRFortessa
FACSDIVA	BD Bioscience	FACSDIVA (v8.0.1)