En In Vitro Assay att upptäcka tRNA-Isopentenyl transferas aktivitet
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för biokemisk karakterisering av jäst RNA-modifiera enzymet, Mod5, och diskutera hur detta protokoll skulle kunna tillämpas på andra RNA-ändra enzymer.
Abstract
N6– isopentenyladenosine RNA modifieringar är funktionellt mångsidig och mycket bevarat bland prokaryoter och Eukaryoter. En av de mest mycket N6– isopentenyladenosine ändringarna uppstår vid A37 position i en delmängd av tRNAs. Ändringen förbättrar översättning effektivitet och trohet genom att öka tRNAen affinitet för Ribosomen. Mutation av enzymer som ansvarar för denna ändring i Eukaryoter är associerade med flera sjukdomstillstånd, inklusive mitokondriell dysfunktion och cancer. Därför är det viktigt för förståelse av normal och patologisk eukaryota biologi att förstå substrat specificitet och biokemiska aktiviteter av dessa enzymer. En mångfald av metoder har använts för att karakterisera jag6A modifieringar. Är häri beskrivs en direkt metod för detektion av isopentenylation av Mod5. Denna metod använder tredjeparts inkubation av RNAs med en rekombinant isopentenyl transferas, följt av RNase T1 matsmältningen och 1-dimensionella gelelektrofores analys till upptäcka jag6A modifieringar. Dessutom diskuteras detta protokoll att karakterisera andra RNA-ändra enzymer potentiella anpassningsförmåga.
Introduction
Minst 163 distinkta postttransskriptionell RNA ändringar har identifierats, med dessa ändringar ger varierande och innehållsberoende funktioner till RNAs, direkt påverka RNA struktur, och som påverkar samspelet mellan RNA med andra molekyler1,2. Som uppskattning för antal och mängd RNA ändringar ökar, är det viktigt att utveckla analyser som tillförlitligt kan förhöra både RNA ändringarna och de enzymer som katalyserar dem.
En av de första RNA ändringarna identifieras uppstår vid basen 37 i tRNAs, intill den anti Codonen på 3′ sida3,4. En isopentenyl grupp överförs från dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) till N6 position av adenosin 37 (jag6A37) 3,5 på en delmängd av både cytoplasmiska och mitokondrie tRNAs. Jag6A37 förbättrar översättning trohet och effektivitet genom att öka den tRNAen affinitet för de Ribosomen4,6 och jag6A37 är viktigt för stress i bakterier7. De enzymer som utför denna ändring kallas tRNA isopentenyl transferaser och är starkt konservativa i bakterier8,9, svampar10, maskar11, växter12och högre eukaryotes13 , inklusive människor14.
Mutationer i mänskliga tRNA isopentenyl transferas gen, TRIT1, är associerade med mänskliga sjukdomar. Exempelvis är en mutation i TRIT1 korrelerad med en svår mitokondriell sjukdom, troligen orsakad av en defekt i mitokondriell proteinsyntes15,16. Dessutom TRIT1 har beskrivits som en tumör suppressor genen17,18 och är inblandad i flera typer av cancer inklusive melanom19, bröst20, gastric21och lung cancer22 ,23. Slutligen TRIT1 och Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl transferaser är aggregation-benägen proteiner som bildar prion-liknande amyloid fibrer24,25,26. Dessa observationer implicerade potentiellt tRNA isopentenyl transferaser vid neurodegenerativa sjukdomar, även om direkta bevis för detta inte har ännu visats.
Givna roll att isopentenyl transferaser i översättning och sjukdom, metoder som direkt åtgärd jag6en isopentenyl transferas aktivitet är viktiga för en mekanistisk förståelse av dessa enzymer under normala och stater sjukdom. Det finns ett ökande antal metoder att upptäcka jag6A RNA ändringar, inklusive in vitro- isopentenylation analyser, positiva hybridisering i avsaknad av jag6en (PHA6)-analyser, tunna lager kromatografi (TLC), aminosyra acceptans aktivitet analyser och masspektrometri metoder (granskad i Ref. 4).
En in vitro- isopentenylation assay har beskrivits som använder 14C-DMAPP och omärkt tRNAs. I denna analys överförs radioaktivt kol till RNA från 14C-DMAPP av den isopentenyl-transferasen. Denna analys är mycket känslig, är det ofta svårt att avgöra särskilda restmängd som är modified9,20,27. PHA6 analyser lita på den skrymmande jag6A ändring stör hybridisering av en 32P-märkt sond som spänner över det modifierade rest. Som sådan hybridisering är större i avsaknad av ett i6en ändring18,28,29. PHA6 analyserna är mycket känsliga och kan analysera total-RNA extraherade från cellulära lysates. Dessutom ger möjligheten att designa sonder som är specifika för RNA av intresse denna metod betydande mål flexibilitet. PHA6 analyser är dock begränsade till karakterisering av ändringar som inträffar på rester inom den berörda regionen av sonden och är därför mindre sannolikt att identifiera roman modifiering platser. Dessutom, eftersom avsaknad av bindande är vägledande för modifiering, kommer andra modifieringar eller mutationer som påverkar RNA bindande förbrylla dataanalys.
En annan strategi kombinerar bensyl DEAE-cellulosa (BD) cellulosa kromatografi med aminosyran acceptans verksamhet en avläsning av i6A ändringar i tRNA30. Detta tillvägagångssätt analyser direkt funktion av i6A ändring, men det är en indirekt metod att upptäcka jag6A modifiering och saknar resolution att mappa ändringar av en specifik rester i RNA. En TLC tillvägagångssätt har använts att upptäcka totala tRNA jag6A modifieringar. I denna strategi, internt 32P-märkt tRNAs rötas till enstaka nukleotider och tvådimensionella TLC analys används för att identifiera isopentenylation. Detta tillvägagångssätt är mycket känsliga i upptäckande totalt jag6A i ett givet RNA-prov men vid matsmältning, alla sekvensinformation går förlorad; Utredaren har således, inget sätt att fastställa vilka rester har varit modifierad31.
Mer nyligen, liquid chromatography-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) metoder har utvecklats som kvantitativt jämför totala RNA ändringar mellan arter, celltyper och experimentella förhållanden32,33, 34. En begränsning av denna metod är att det är mindre kunna fastställa identitet och ställning inom RNA som var den modifierade nukleosiden härrör34. Dessutom begränsa den expertis och utrustning som är nödvändiga för att genomföra dessa experiment praktiskhet i denna strategi.
Dessutom har flera nästa generations sekvensering teknik utvecklats för att mappa RNA ändringar transkriptom hela34. Immunoprecipitation av RNAs med antikroppar som är specifika för en viss modifiering (RIP-Seq) gör det möjligt för utredaren att identifiera alla sekvenser som innehåller en specifik ändring35,36. Omvänt transkriptas-baserade metoder såsom Chem-Seq och icke-slumpmässigt mismatch sekvensering är dessutom beroende av störningar av omvänd Transkription reaktionen vid den modifierade rester37,38,39. Trots fördelen med dessa tekniker för att mappa RNA ändringar transkriptom-wide, begränsas RIP-seq och Chem-Seq teknik av bristen på tillförlitliga antikroppar eller reaktiva kemikalier tillgänglig för varje specifik modifiering, respektive34. Dessutom omvänt transkriptas enzymer för att utföra Chem-Seq och icke-slumpmässigt mismatch sekvensering tekniker kan hindras genom stabila RNA strukturer. Den starkt modifierade och strukturellt stabil karaktären tRNAs gör dem särskilt svårt att förhöra använda dessa tekniker. Hittills har nästa generations sekvensering-baserad teknik inte ännu använts till karta jag6en ändringar34.
Häri, beskriver vi en enkel och direkt inställning till upptäcka jag6A tRNA ändringar in vitro. Denna metod använder tredjeparts inkubering av RNAs med rekombinant S. cerevisiae isopentenyl transferas (Mod5), följt av RNase T1 matsmältningen och 1-dimensionella gelelektrofores analys för att kartlägga jag6A modifieringar. Denna strategi är direkt och kräver lite specialiserad expertis för att analysera data. Dessutom är denna metod anpassas till andra RNA ändra enzymer, inklusive enzymer som kovalent ändrar den molekylära vikten av RNA eller en RNA rörlighet genom en gel.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA ändringar fortsätter att visas att spela allt mer viktiga och olikartade roller i cellulär och organismers funktion. Som sådan, är utvecklingen av analyser att förhöra RNA ändra enzymer central för att bättre förstå de grundläggande aspekterna av biologi. Det här protokollet beskriver en högupplöst in vitro- test för att karakterisera aktiviteten tRNA modifiering av Mod5.
Detta protokoll har den klara fördelen att ge en direkt och lätt tolkningsbara avläsning a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr David Engelke för hans vägledning och hjälpsamma kommentarer på detta manuskript. PJS – Ball State University laboratorium start medel. DAB – bevilja 1R15AI130950-01.
Materials
| Reagents | |||
| UreaGel Concentrate | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Diluent | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| UreaGel Buffer | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| 10x TBE | National Diagnostics | EC-833 | As part of a kit |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 7727-54-0 | |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 10043-35-3 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | 34369-07-8 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| DMAPP | Caymen Chemical | 1186-30-7 | |
| Super RNaseIN | ThermoFisher Scientific | AM2694 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| Sodiume acetate | Sigma-Aldrich | 127-09-3 | |
| Rnase T1 | ThermoFisher Scientific | EN0541 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Equipment and Supplies | |||
| Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L) | The Gel Company | ||
| Vertical gel apparatus | The Gel Company | S2-3040 | |
| 50 mL disposable syringe | Fisher Scientific | 03-377-26 | |
| Stainless steel binder clips | Idea Scientific | 1066 | |
| Phosphoscreen | Sigma-Aldrich | 28-9564-74 | |
| Plastic wrap | (local grocery store) |
References
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).
- Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions. Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).
- Soll, D. Enzymatic modification of transfer RNA. Science. 173 (3994), 293-299 (1971).
- Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA. RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).
- Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA. Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).
- Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications. EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).
- Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation. RNA. 22 (5), 729-742 (2016).
- Caillet, J., Droogmans, L. Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA. Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop. Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).
- Dihanich, M. E., et al. Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).
- Lemieux, J., et al. Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria. Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).
- Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana. Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).
- Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells. Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).
- Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase. Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).
- Kernohan, K. D., et al. Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene. Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).
- Yarham, J. W., et al. Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA. PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).
- Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer. Gene. 556 (1), 13-18 (2015).
- Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).
- Swoboda, R. K., et al. Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3′ untranslated region of TRIT1. Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).
- Yue, Z., et al. Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information. Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).
- Chen, S., et al. Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population. Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).
- Spinola, M., et al. Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer. Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).
- Spinola, M., et al. Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients’ survival. Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).
- Read, D. F., et al. Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing. FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).
- Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro. Gene. 612, 19-24 (2017).
- Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
- Soderberg, T., Poulter, C. D. Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues. Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).
- Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases. Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).
- Lamichhane, T. N., et al. Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast. Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).
- Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).
- Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence. Cell. 18 (1), 11-26 (1979).
- Yan, M., et al. A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes. Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).
- Su, D., et al. Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry. Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Dominissini, D., et al. The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
- Meyer, K. D., et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3′ UTRs and near stop codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Schwartz, S., et al. Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA. Cell. 159 (1), 148-162 (2014).
- Schwartz, S., et al. High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis. Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).
- Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA. Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).
- Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. Tackling structures of long noncoding RNAs. International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).
