En anjon utbyta resin-baserade metod, anpassat till vätska impingement-baserade bioaerosol provtagning av virus kan påvisas. När tillsammans med nedströms molekylär identifiering, kan metoden för lättköpt och känslig detektion av virus från bioaerosoler.
Detta protokoll visar anpassade bioaerosol provtagningsmetod för virus. I detta system, är exchange anjonharts tillsammans med flytande impingement-baserade air provtagning enheter för effektiv koncentration av negativt laddade virus från bioaerosoler. Kådan fungerar således som en ytterligare koncentration steget i arbetsflödet bioaerosol provtagning. Nukleinsyra utvinning av viral partiklarna utförs sedan direkt från den exchange anjonharts, med resulterande provet passar molekylära analyser. Ytterligare, det här protokollet beskriver en specialbyggd bioaerosol kammare kan generera virus-lastad bioaerosoler under olika miljöförhållanden och möjliggör kontinuerlig övervakning av miljömässiga variabler såsom temperatur, vindhastighet och aerosol masskoncentrationen. Den största fördelen med detta protokoll är ökad känslighet för virus upptäckt, bedömning via direkt jämförelse till en omodifierad konventionella flytande impinger. Andra fördelar inkluderar potential att koncentrera olika negativt laddade virus, den låga kostnaden för exchange anjonharts (~$0.14 per prov), och användarvänlighet. Nackdelarna inkluderar detta protokoll oförmåga att bedöma smittsamhet av harts-adsorberat viruspartiklar, och potentiellt behov av optimering av flytande provtagning bufferten används inom impinger.
Syftet med denna metod är att ge en mycket känslig bioaerosol provtagning plattform för att underlätta molekylär detektion av negativt laddade virus från bioaerosoler. Mikroorganismer, inklusive viruspartiklar, kan överleva i bioaerosoler under längre tid1. Bioaerosoler kan resa över relativt långa avstånd och upprätthålla livsduglighet och smittsamhet, vilket framgår av ett utbrott av legionärssjuka som härstammar från industriella kyltorn som ligger på ett avstånd av 6 km från de drabbade individerna och resulterade i 18 dödsfall2. Indirekt överföring av virus till människor som medieras av bioaerosoler kan förekomma i flera inställningar och har visats för norovirus utbrott i skolor och restauranger3,4. Likaså kan bioaerosol överföring av virus förekomma i jordbruket inställningar såsom i svin och fjäderfä gårdar, med denna överföring rutten betraktas som en viktig faktor i rörelsen av virus mellan produktions faciliteter5, 6 , 7 , 8 , 9.
Effektivt urval av virus-lastad bioaerosoler möjliggör förbättring av snabb diagnostik och beredskapen för utbrott förebyggande, som visas i demonstrationer i vilken H5 influensa ett virus upptäcktes från bioaerosoler i levande djur marknaderna i Kina och USA10,11. Nuvarande teknik för provtagning av bioaerosol involverar ett antal olika partikel fånga principer, och i stort sett kan delas in i impingers, cykloner, slagkvarnar och filter12. Det är bortom räckvidden av detta protokoll att uttömmande täcka alla fördelar och nackdelar med dessa plattformar för provtagning av virus från bioaerosoler; Det kan dock konstateras att majoriteten av enheterna provtagning inte har optimerats för insamling av virus och bakteriofager13. Dessutom påverkas smittsamhet av viruspartiklar ofta negativt, med flytande impingers som anses upprätthålla viral smittsamhet mer effektivt än provtagning enheter såsom fast slagkvarnar eller filter14. En nackdel med flytande impingement är dock målet utspädningseffekten, vilket beror på att virus är insamlade i relativt stora volymer (vanligtvis ≥20 mL) av vätska i uppsamlingskärlet. En annan viktig nackdel innebär suboptimala effektiviteten i flytande impingers att koncentrera partiklar < 0.5 µM i storlek15. Uppsamlingskapacitet av dessa enheter kan dock förbättras genom immobilisering på fasta matriser, som immobilisering kan förbättra bevarandet av viral nukleinsyror och viral smittsamhet16,17.
Vi har tidigare visat att anjonharts exchange är ett effektivt verktyg för avskiljning och koncentrationen av virus från flytande matriser, inklusive F-RNA bakteriofager, hepatit A-virus, humant adenovirus och rotavirus18,19 ,20. Enligt definitionen av tillverkaren, är den anjonharts för exchange som utnyttjas i detta arbete en macroreticular polystyren stark bas anjon exchange harts där functionalized Kvartära amine grupper medla attraktion och fånga av anjoner i ett flytande medium21 . Följaktligen, den exchange anjonharts förväntas fånga virus med net-negativa ytladdningar, inklusive många enterovirus, influensavirus och andra virus som är relevanta för människors och djurs hälsa.
Det nuvarande protokollet innebär tillägg av anjonharts exchange till en flytande impinger. I detta system fungerar kådan som en sekundär koncentration steg för viruspartiklar fångade i impinger vätskan. Nukleinsyror kan sedan vara direkt elueras i små volymer, som ger ett koncentrerat urval för molekylära analyser. Den största fördelen med denna metod är således förbättringen i viral upptäckt känslighet, främst genom minskning av provvolymen. Dessutom, på grund av den inneboende ospecifika fångst av negativt laddade virus, metoden sannolikt gäller för detektion av ett stort antal virus av intresse. Här demonstreras metoden för vaccinstammar av typ A och typ B influensavirus och den FRNA coliphage MS2 (MS2). Dessa virus upptäcks därefter med standard qRT-PCR-analyser som tidigare beskrivits22. Slutpunkten användaren bör inte räkna med att stöta på svårigheter i att utföra denna metod, eftersom ändringar av befintliga utrustning utgör inte stora störningar konventionella flödet av bioaerosol provtagning och analys.
Detta protokoll beskriver en metod för känsliga viral fånga från bioaerosoler använder modifierade flytande impingers. Metoden är optimerad för detektion och kvantifiering av virusmängd i bioaerosoler. Den specifika ändringen visat här innebär tillägg av exchange anjonharts till vätska som ingår i en gemensam flytande impinger. Denna metod utvecklades för sin enkelhet i nedströms prov bearbetning, medan andra prov bearbetning tekniker såsom centrifugering, filtrering och nederbörd-baserade metoder inte …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av finansiering från CDC/NIOSH High Plains Intermountain centrum för jordbruket hälsa och säkerhet (5U54OH008085) och Colorado Bioscience utvärdering Grant Discoveryprogrammet (14BGF-16).
Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
1 mL pipet tips | NA | NA | |
1 mL pipettor | NA | NA | |
50 mL serological pipet | NA | NA | |
PCR tubes | NA | NA | |
Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
HEPA capsule | PALL | 12144 | |
Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
Bioaerosol chamber | NA | NA |