Detektion av virus från bioaerosoler använder Exchange anjonharts
Summary
En anjon utbyta resin-baserade metod, anpassat till vätska impingement-baserade bioaerosol provtagning av virus kan påvisas. När tillsammans med nedströms molekylär identifiering, kan metoden för lättköpt och känslig detektion av virus från bioaerosoler.
Abstract
Detta protokoll visar anpassade bioaerosol provtagningsmetod för virus. I detta system, är exchange anjonharts tillsammans med flytande impingement-baserade air provtagning enheter för effektiv koncentration av negativt laddade virus från bioaerosoler. Kådan fungerar således som en ytterligare koncentration steget i arbetsflödet bioaerosol provtagning. Nukleinsyra utvinning av viral partiklarna utförs sedan direkt från den exchange anjonharts, med resulterande provet passar molekylära analyser. Ytterligare, det här protokollet beskriver en specialbyggd bioaerosol kammare kan generera virus-lastad bioaerosoler under olika miljöförhållanden och möjliggör kontinuerlig övervakning av miljömässiga variabler såsom temperatur, vindhastighet och aerosol masskoncentrationen. Den största fördelen med detta protokoll är ökad känslighet för virus upptäckt, bedömning via direkt jämförelse till en omodifierad konventionella flytande impinger. Andra fördelar inkluderar potential att koncentrera olika negativt laddade virus, den låga kostnaden för exchange anjonharts (~$0.14 per prov), och användarvänlighet. Nackdelarna inkluderar detta protokoll oförmåga att bedöma smittsamhet av harts-adsorberat viruspartiklar, och potentiellt behov av optimering av flytande provtagning bufferten används inom impinger.
Introduction
Syftet med denna metod är att ge en mycket känslig bioaerosol provtagning plattform för att underlätta molekylär detektion av negativt laddade virus från bioaerosoler. Mikroorganismer, inklusive viruspartiklar, kan överleva i bioaerosoler under längre tid1. Bioaerosoler kan resa över relativt långa avstånd och upprätthålla livsduglighet och smittsamhet, vilket framgår av ett utbrott av legionärssjuka som härstammar från industriella kyltorn som ligger på ett avstånd av 6 km från de drabbade individerna och resulterade i 18 dödsfall2. Indirekt överföring av virus till människor som medieras av bioaerosoler kan förekomma i flera inställningar och har visats för norovirus utbrott i skolor och restauranger3,4. Likaså kan bioaerosol överföring av virus förekomma i jordbruket inställningar såsom i svin och fjäderfä gårdar, med denna överföring rutten betraktas som en viktig faktor i rörelsen av virus mellan produktions faciliteter5, 6 , 7 , 8 , 9.
Effektivt urval av virus-lastad bioaerosoler möjliggör förbättring av snabb diagnostik och beredskapen för utbrott förebyggande, som visas i demonstrationer i vilken H5 influensa ett virus upptäcktes från bioaerosoler i levande djur marknaderna i Kina och USA10,11. Nuvarande teknik för provtagning av bioaerosol involverar ett antal olika partikel fånga principer, och i stort sett kan delas in i impingers, cykloner, slagkvarnar och filter12. Det är bortom räckvidden av detta protokoll att uttömmande täcka alla fördelar och nackdelar med dessa plattformar för provtagning av virus från bioaerosoler; Det kan dock konstateras att majoriteten av enheterna provtagning inte har optimerats för insamling av virus och bakteriofager13. Dessutom påverkas smittsamhet av viruspartiklar ofta negativt, med flytande impingers som anses upprätthålla viral smittsamhet mer effektivt än provtagning enheter såsom fast slagkvarnar eller filter14. En nackdel med flytande impingement är dock målet utspädningseffekten, vilket beror på att virus är insamlade i relativt stora volymer (vanligtvis ≥20 mL) av vätska i uppsamlingskärlet. En annan viktig nackdel innebär suboptimala effektiviteten i flytande impingers att koncentrera partiklar < 0.5 µM i storlek15. Uppsamlingskapacitet av dessa enheter kan dock förbättras genom immobilisering på fasta matriser, som immobilisering kan förbättra bevarandet av viral nukleinsyror och viral smittsamhet16,17.
Vi har tidigare visat att anjonharts exchange är ett effektivt verktyg för avskiljning och koncentrationen av virus från flytande matriser, inklusive F-RNA bakteriofager, hepatit A-virus, humant adenovirus och rotavirus18,19 ,20. Enligt definitionen av tillverkaren, är den anjonharts för exchange som utnyttjas i detta arbete en macroreticular polystyren stark bas anjon exchange harts där functionalized Kvartära amine grupper medla attraktion och fånga av anjoner i ett flytande medium21 . Följaktligen, den exchange anjonharts förväntas fånga virus med net-negativa ytladdningar, inklusive många enterovirus, influensavirus och andra virus som är relevanta för människors och djurs hälsa.
Det nuvarande protokollet innebär tillägg av anjonharts exchange till en flytande impinger. I detta system fungerar kådan som en sekundär koncentration steg för viruspartiklar fångade i impinger vätskan. Nukleinsyror kan sedan vara direkt elueras i små volymer, som ger ett koncentrerat urval för molekylära analyser. Den största fördelen med denna metod är således förbättringen i viral upptäckt känslighet, främst genom minskning av provvolymen. Dessutom, på grund av den inneboende ospecifika fångst av negativt laddade virus, metoden sannolikt gäller för detektion av ett stort antal virus av intresse. Här demonstreras metoden för vaccinstammar av typ A och typ B influensavirus och den FRNA coliphage MS2 (MS2). Dessa virus upptäcks därefter med standard qRT-PCR-analyser som tidigare beskrivits22. Slutpunkten användaren bör inte räkna med att stöta på svårigheter i att utföra denna metod, eftersom ändringar av befintliga utrustning utgör inte stora störningar konventionella flödet av bioaerosol provtagning och analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för känsliga viral fånga från bioaerosoler använder modifierade flytande impingers. Metoden är optimerad för detektion och kvantifiering av virusmängd i bioaerosoler. Den specifika ändringen visat här innebär tillägg av exchange anjonharts till vätska som ingår i en gemensam flytande impinger. Denna metod utvecklades för sin enkelhet i nedströms prov bearbetning, medan andra prov bearbetning tekniker såsom centrifugering, filtrering och nederbörd-baserade metoder inte …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av finansiering från CDC/NIOSH High Plains Intermountain centrum för jordbruket hälsa och säkerhet (5U54OH008085) och Colorado Bioscience utvärdering Grant Discoveryprogrammet (14BGF-16).
Materials
| Escherichia coli bacteriophage MS2 (ATCC 15597-B1) | American Type Culture Collection | ATCC 15597-B1 | |
| FluMist Quadrivalent | AstraZeneca | Contact manufacturer | Viral constitutents of this vaccine are subject to change on an annual basis |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855195 | |
| Primers and probes | Integrated DNA Technologies | NA | |
| 0.2 µM sterile filter | NA | NA | |
| 1 L pyrex bottles or equivalent | NA | NA | |
| 1 mL pipet tips | NA | NA | |
| 1 mL pipettor | NA | NA | |
| 50 mL serological pipet | NA | NA | |
| PCR tubes | NA | NA | |
| Pipet-aid or equivalent | NA | NA | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | Qiagen | 52904 | |
| QuantiTect Probe RT-PCR Kit | Qiagen | 204443 | |
| Amberlite IRA-900 chloride form | Sigma-Aldrich | 216585-500G | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Water (molecular biology grade) | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Eppendorf DNA LoBind Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher | 13-698-791 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 14-432-22 | |
| Falcon Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 05-538-62 | |
| SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit w/ROX | ThermoFisher | 11745100 | |
| SKC Biosampler 20 mL, 3-piece glass set | SKC Inc. | 225-9593 | |
| Vac-u-Go sample pumps | SKC Inc. | 228-9695 | |
| Collison nebulizer (6-jet) | BGI Inc. | NA | |
| HEPA capsule | PALL | 12144 | |
| Q-TRAK indoor air quality monitor 8554 | TSI Inc. | NA | |
| Alnor velometer thermal anemometer AVM440-A | TSI Inc. | NA | |
| SidePak AM510 personal aerosol monitor | TSI Inc. | NA | |
| Bioaerosol chamber | NA | NA |
Riferimenti
- Pirtle, E. C., Beran, G. W. Virus survival in the environment. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). 10 (3), 733-748 (1991).
- Nguyen, T. M., et al. A community-wide outbreak of legionnaires disease linked to industrial cooling towers–how far can contaminated aerosols spread?. The Journal of Infectious Diseases. 193 (1), 102-111 (2006).
- Marks, P. J., et al. Evidence for airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiology and Infection. 124 (3), 481-487 (2000).
- Marks, P. J., et al. A school outbreak of Norwalk-like virus: Evidence for airborne transmission. Epidemiology and Infection. 131 (1), 727-736 (2003).
- Corzo, C. A., Culhane, M., Dee, S., Morrison, R. B., Torremorell, M. Airborne detection and quantification of swine influenza a virus in air samples collected inside, outside and downwind from swine barns. PLoS One. 8 (8), e71444 (2013).
- Anderson, B. D., et al. Bioaerosol sampling in modern agriculture: A novel approach for emerging pathogen surveillance. The Journal of Infectious Diseases. 214 (4), 537-545 (2016).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 17 (2), 198-200 (2005).
- Jonges, M., et al. Wind-mediated spread of low-pathogenic avian influenza virus into the environment during outbreaks at commercial poultry farms. PLoS One. 10 (5), e0125401 (2015).
- Otake, S., Dee, S. A., Jacobson, L., Torremorell, M., Pijoan, C. Evaluation of aerosol transmission of porcine reproductive and respiratory syndrome virus under controlled field conditions. The Veterinary Record. 150 (26), 804-808 (2002).
- Wu, Y., et al. Aerosolized avian influenza A (H5N6) virus isolated from a live poultry market, China. The Journal of Infection. 74 (1), 89-91 (2017).
- Choi, M. J., et al. Live animal markets in Minnesota: A potential source for emergence of novel influenza A viruses and interspecies transmission. Clinical Infectious Diseases. 61 (9), 1355-1362 (2015).
- Haig, C. W., Mackay, W. G., Walker, J. T., Williams, C. Bioaerosol sampling: Sampling mechanisms, bioefficiency and field studies. The Journal of Hospical Infection. 93 (3), 242-255 (2016).
- Anderson, B. D., Lednicky, J. A., Torremorell, M., Gray, G. C. The use of bioaerosol aampling for airborne virus surveillance in swine production facilities: A mini review. Frontiers in Veterinary Science. 4, 121 (2017).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 413-444 (2008).
- Hogan, C. J. Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicrometre and ultrafine virus aerosol particles. Journal of Applied Microbiology. 99 (6), 1422-1434 (2005).
- Yu, K. -. P., Chen, Y. -. P., Gong, J. -. Y., Chen, Y. -. C., Cheng, C. -. C. Improving the collection efficiency of the liquid impinger for ultrafine particles and viral aerosols by applying granular bed filtration. Journal of Aerosol Science. 101, 133-143 (2016).
- Perez-Mendez, A., et al. Evaluation of a simple and cost effective filter paper-based shipping and storage medium for environmental sampling of F-RNA coliphages. J Virol Methods. 194 (1-2), 60-66 (2013).
- Chandler, J. C., et al. Field-based evaluation of a male-specific (F+) RNA coliphage concentration method. Journal of Virological Methods. 239, 9-16 (2017).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Concentration of enteric viruses from tap water using an anion exchange resin-based method. Journal of Virological Methods. 206, 95-98 (2014).
- Perez-Mendez, A., Chandler, J. C., Bisha, B., Goodridge, L. D. Evaluation of an anion exchange resin-based method for concentration of F-RNA coliphages (enteric virus indicators) from water samples. Journal of Virological Methods. 204, 109-115 (2014).
- Kammerer, J., Carle, R., Kammerer, D. R. Adsorption and ion exchange: Basic principles and their application in food processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59 (1), 22-42 (2011).
- Chandler, J. C., et al. A method for the improved detection of aerosolized influenza viruses and the male-specific (F+) RNA coliphage MS2. Journal of Virological Methods. 246, 38-41 (2017).
- Friedman, S. D., Cooper, E. M., Calci, K. R., Genthner, F. J. Design and assessment of a real time reverse transcription-PCR method to genotype single-stranded RNA male-specific coliphages (Family Leviviridae). Journal of Virological Methods. 173 (2), 196-202 (2011).
- Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. Evaluation of three influenza A and B real-time reverse transcription-PCR assays and a new 2009 H1N1 assay for detection of influenza viruses. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 3870-3875 (2010).
- Cademartiri, R., et al. Immobilization of bacteriophages on modified silica particles. Biomaterials. 31 (7), 1904-1910 (2010).
- Michen, B., Graule, T. Isoelectric points of viruses. Journal of Appled Microbiology. 109 (2), 388-397 (2010).
- Turgeon, N., Toulouse, M. J., Martel, B., Moineau, S., Duchaine, C. Comparison of five bacteriophages as models for viral aerosol studies. Applied and Environmental Microbiology. 80 (14), 4242-4250 (2014).
- Vergara, G. G., et al. Evaluation of FRNA coliphages as indicators of human enteric viruses in a tropical urban freshwater catchment. Water Research. 79, 39-47 (2015).
- Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. Aerosolization of a human norovirus surrogate, bacteriophage MS2, during simulated vomiting. PLoS One. 10 (8), e0134277 (2015).
