Hele cellen Elektrofysiologi primær kulturperler Murine Enterochromaffin celler
Summary
Enterochromaffin (EF) celler omfatter en lille delmængde af gastrointestinale epitelceller. EF celler er elektrisk overgearet og frigive serotonin, men vanskeligheder i dyrkning og identificere EF celler har begrænset fysiologiske undersøgelser. Metoden præsenteres her etablerer en primær kultur model imødekommenhed over for undersøgelse af enkelt EF celler af Elektrofysiologi.
Abstract
Enterochromaffin (EF) celler i den gastrointestinal (GI) epitel udgør den største delpopulation af enteroendocrine celler. Som specialiseret sensoriske celler, EF celler fornemme luminale stimuli og konvertere dem til serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release begivenheder. Dog er Elektrofysiologi af disse celler dårligt forstået, fordi de er vanskelige at kultur og identificere. Metoden fremlægges i dette papir skitserer primære EF cellekulturer optimeret til enkelt celle Elektrofysiologi. Denne protokol udnytter en transgene cyan fluorescerende proteiner (FFP) reporter for at identificere mus EF celler i blandet primære kulturer, fremme tilgangen til at opnå høj kvalitet optagelser af hele cellen Elektrofysiologi i spænding og strøm klemme tilstande.
Introduction
Gastrointestinale (GI) epitel er et mangfoldigt samfund består af flere celletyper. Enteroendocrine celler udgør omkring 1% af alle epitelceller, og enterochromaffin (EF) celler er den største enteroendocrine celle befolkning1. Nylige undersøgelser viser, at enteroendocrine2 og EF3,4 celler er elektrisk overgearet. Vi er interesseret i at forstå primære EF celle Elektrofysiologi. Således er var formålet med denne undersøgelse at etablere primære EF cellekulturer optimeret til hele cellen Elektrofysiologi.
Eksisterende EF-celle linier, der producerer og udskiller 5-HT (f.eks. QGP-15, BON6, KRJ-17) og har været brugt til at undersøge Elektrofysiologi5,8 er typisk genereres fra udødeliggjort neoplastiske væv. Mens de oplysninger, der er erhvervet fra disse cellelinjer er værdifulde5,8, er undersøgelser af primære celle Elektrofysiologi nødvendigt at korrekt forstå EF celle fysiologi. Elektrofysiologi primær EF celler kræver isolering og kultur af enkelt epitelceller, som har været begrænset af lav rentabilitet af epitel kulturer.
Metoden kultur præsenteres i denne undersøgelse er afhængig af Transgene mus med fluorescently mærket EF celler, som Tph1-fælles fiskeripolitik9, brugt i denne undersøgelse. Metoden optimerer blandet primære epitelial kulturer udviklet tidligere2,10 for enkelt celle Elektrofysiologi3. Tidligere metoder anvendes kombinationer af Trypsin/EDTA plus Collagenase A eller EDTA og DTT for enzymatisk fordøjelsen og brugt tæthed gradienter at specifikt isolere og kultur marsvin11 og rotte EF celler12. Mere nylig, tarm organoids blev genereret og mekanisk forstyrret for elektrofysiologiske optagelser4. Kulturer ved hjælp af disse metoder er velegnede for serotonin frigive eksperimenter, RT-qPCR analyse, og mens de kunne bruges til Elektrofysiologi, er afhængige af succesen af tidskrævende organoid generation, tæthed gradienter at identificere EF celler, og de cellulære forstyrrende virkninger af Trypsin og EDTA. Derimod protokollen beskrevet her forbedrer enzymatiske og mekaniske behandlinger, optimerer dyrkningsbaserede betingelser, og strømliner procedurerne for at producere enkelt og sundt EF celler egnet til de høje cellulære standarder behov for Elektrofysiologi.
Denne metode vil være nyttig for forskere, der ønsker at arbejde på primære EF celler i blandede kulturer i stedet udødeliggjort kulturer og vil undersøge Elektrofysiologi af enkelt celler. Men det kan vise sig mindre egnede til at studere cellepopulationer, der har brug for sortering eller langsigtede kulturer, der kræver overlevelse sidste 72 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fuldt ud forstå EF cellefunktion kræver en høj kvalitet primære kultur metode til at generere celler for hele cellen Elektrofysiologi. Primære kulturer af GI epitel havde traditionelt været vanskelig på grund af lav overlevelse. Lindre denne konfunderende faktor, udbytter den nuværende metode kulturer af ental EF celler fra enten små eller store tarm, der er i stand til at overleve i flere dage.
Vi fandt, at de var afgørende for forbedring af kvaliteten af kulturer at være egnet til…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takke fru Lyndsay Busby for administrativ bistand og Mr. Robert Highet fra Mayo Clinic Division of Engineering for design og 3D udskrivning af kultur parabol Indsæt. Dette arbejde blev støttet af NIH K08 til AB (DK106456)-, Pilot- og Feasibility tilskud til AB fra Mayo Clinic Center for celle signalering i gastroenterologi (NIH P30DK084567) og 2015 amerikanske allergierbortsetfraastma Association forskning Scholar Award (AGA RSA) til AB og NIH R01 til GF (DK52766).
Materials
| High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
| Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
| 100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
| 50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
| 15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
| 1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
| MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
| Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
| Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
| Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
| Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| 3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| Electrophysiology Equipment | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
Riferimenti
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The “normal” endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, 1081-1093 (2011).
- Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
- Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
- Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
- Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
- Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
- Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
- Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
- Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, 5959-5975 (2013).
- Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
