Hele cellen elektrofysiologi primære kulturperler Murine Enterochromaffin celler
Summary
Enterochromaffin (EC) celler utgjør en undergruppe av gastrointestinale epitelceller. EC celler er elektrisk nervøs og slipp serotonin, men vanskeligheter i dyrking og identifisere EC celler har begrenset fysiologiske studier. Metoden som presenteres her oppretter en primær kultur modell mottakelig for undersøkelse av EC enkeltceller av elektrofysiologi.
Abstract
Enterochromaffin (EC) celler i gastrointestinal (GI) epitel utgjør den største subpopulasjon av enteroendocrine celler. Som spesialiserte sensoriske celler, EC celler forstand luminal stimuli og konvertere dem til serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) løslate hendelser. Imidlertid er elektrofysiologi av disse cellene dårlig forstått fordi de er vanskelige å kultur og identifisere. Metoden presentert i dette papiret beskriver primære EC cellekulturer optimalisert for enkeltcelle elektrofysiologi. Denne protokollen bruker transgene cyan fluorescerende protein (CFP) reporter identifisere musen EC celler i blandet primære kulturer, fremme tilnærming til å få høykvalitets opptak av hele cellen elektrofysiologi i spenning og strøm klemme moduser.
Introduction
Gastrointestinal (GI) epitel er et mangfoldig samfunn bestående av flere celletyper. Enteroendocrine celler utgjør omtrent 1% av alle epitelceller enterochromaffin (EC) celler er den største enteroendocrine celle befolkning1. Nyere studier viser at enteroendocrine2 og EF3,4 celler er elektrisk nervøs. Vi er interessert i å forstå primære EC celle elektrofysiologi. Dermed var formålet med denne studien å etablere primære EC cellekulturer optimalisert for hele cellen elektrofysiologi.
Eksisterende EC cellen linjer som produserer og skiller ut 5-HT (f.eks QGP-1-5, BON6, KRJ-1-7) og har blitt brukt til å undersøke elektrofysiologi5,8 genereres vanligvis fra udødeliggjort neoplastic vev. Mens informasjonen fra disse linjer er verdifulle5,8, er studier av primære celle elektrofysiologi nødvendig å riktig forstå EC celle fysiologi. Elektrofysiologi primære EC celler krever isolasjon og kultur av enkelt epitelceller, som har vært begrenset av lave levedyktigheten til epithelial kulturer.
Metoden kultur presentert i denne studien er avhengig av transgene mus med fluorescently merket EC celler, som Tph1-CFP9, brukt i denne studien. Metoden optimaliserer blandet primære epithelial kulturer utviklet tidligere2,10 for enkelt celle elektrofysiologi3. Tidligere metoder brukt kombinasjoner av Trypsin/EDTA pluss Collagenase A eller EDTA og DTT enzymatisk fordøyelsen og brukt tetthet forløpninger spesielt isolere og kultur marsvin11 og rotten EC celler12. Flere nylig, intestinal organoids ble generert og mekanisk forstyrret for elektrofysiologiske opptak4. Kulturer ved hjelp av disse metodene er godt egnet for serotonin løslate eksperimenter, RT-qPCR analyse og, mens de kan brukes for elektrofysiologi, er avhengig av suksessen til tidkrevende organoid generasjon, tetthet forløpninger å identifisere EC celler, og mobilnettet nedbrytende effekten av Trypsin og EDTA. Derimot protokollen beskrevet her forbedrer enzymatisk og mekanisk, optimaliserer dyrking forhold, og strømlinjeformer prosedyrer for å produsere én og sunn EC celler egnet høye mobilnettet standarder nødvendig for elektrofysiologi.
Denne metoden vil være nyttig for forskere som ønsker å jobbe på primære EC celler i blandet kulturer i stedet for udødeliggjort kulturer og vil undersøke elektrofysiologi i enkeltceller. Imidlertid kan det være færre passende for å studere celle populasjoner som trenger sortering eller langsiktig kulturer som krever overlevelse siste 72 h.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fullt forstå EC celle-funksjonen krever en høy kvalitet primære kultur metode for å generere celler for hele cellen elektrofysiologi. Primære kulturer av GI epitel hadde tradisjonelt vært vanskelig på grunn av lav overlevelse. Lindre dette forvirrende faktor, gir metoden finnes kulturer entall EC celler fra store eller små tarm som kan overleve i flere dager.
Vi fant at følgende var kritiske for å forbedre kvaliteten på kulturer å være egnet for elektrofysiologi: (1) invertere muc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker fru Lyndsay Busby for administrativ hjelp og Mr. Robert Highet fra Mayo Clinic Division of Engineering design og 3D-utskrift av kultur parabol sette. Dette arbeidet ble støttet av NIH K08 AB (DK106456), Pilot og gjennomførbarhet stipend til AB fra Mayo Clinic Center for cellen signalering i gastroenterologi (NIH P30DK084567) og 2015 American gastroenterologisk avdeling Association forskning Scholar Award (AGA RSA) AB og NIH R01 til GF (DK52766).
Materials
| High Glucose DMEM | Sigma | D6546 | Store at 4˚ C for no longer than 1 month |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | F4135 | Freeze in 25 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Penicillin/ Streptomycin | Sigma | P0781 | Freeze in 5 mL aliquots and store long term at -20˚ C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Store at 4˚ C for long term storage |
| Collagenase XI | Sigma | C9407 | Store at -20˚ C in aliquots of 100mg, avoid freeze thaw and avoid lot to lot variation |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), w/ Ca and Mg | Sigma | D8662 | Store long term at 4˚ C |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | StemCell | 72304 | Resuspend at 5mM and store in small aliquots at -80˚ C |
| 100x15mm culture dish | Corning (Falcon) | 351029 | |
| Transfer Pipette | Fisherbrand | 13-711-7M | |
| 10 mL serological pipette | Corning (Falcon) | 357551 | |
| 50 mL Conical | Corning (Falcon) | 352098 | |
| 15 mL Conical | Corning (Falcon) | 352097 | |
| 1000 mL Barrier Pipet Tips | Thermo Scientific (Art) | 2079E | Keep sterile |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Store at 150uL aliquots at -20˚ C. Thaw on ice and keep cold until ready for plating |
| MatTek Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Keep sterile |
| Micro-dissection Forceps – Very Fine, Extra-Long Points | Fine Science Tools | SB12630M | |
| Surgical Scissors-Sharp | Nasco | 14002-14 | |
| Micro-Dissection Scissors | Nasco | SB46568M | |
| Monoject Hypo Needle, 21G x 1" A, 100/BX | Covidien | 8881250172 | |
| Tg(Tph1-CFP)1Able/J Mice | Jackson | Stock # 028366 | Use male or female mice between the ages of 4-7 weeks |
| Microfil nonmetallic syringe needles (34 gauge, 67 mm) | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Parafilm "M" Laboratory Film | Pechiney Plastic Packaging | ||
| R6101 | Dow Corning | ||
| 6-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| 3-mL syringe with regular luer tip | Monoject | ||
| Electrophysiology Equipment | |||
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Data acquisition system (daq) | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Signal conditioner | Molecular Devices | CyberAmp 320 | |
| Software | Molecular Devices | pClamp 10.6 |
Riferimenti
- Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The “normal” endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, 1081-1093 (2011).
- Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
- Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
- Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
- Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
- Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
- Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
- Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
- Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687 (2017).
- Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, 5959-5975 (2013).
- Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
- Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, 161-175 (2005).
