Изоляция и определение внесосудистой иммунных клеток сердца
Summary
Этот протокол предоставляет простой и эффективный метод, чтобы изолировать, выявлять и количественно иммунные клетки, проживающих в миокарде мышей при установившемся или воспаления. Протокол сочетает в себе ферментативные и механических пищеварение для поколения подвеска одну ячейку, которая может быть далее проанализирован подачей cytometry.
Abstract
Иммунная система является важным компонентом здорового сердца. Миокарда является домом для богатых населения различных иммунных клеток подмножеств с функциональной сегментации, как при стационарном, так и в ходе различных форм воспаления. До недавнего времени, исследование иммунных клеток в самом сердце требует использование микроскопии или слабо развита пищеварение протоколы, которые представили достаточно чувствительности во время тяжелое воспаление, но смогли уверенно выявить небольшие — но ключа — население клетки в стационарном состоянии. Здесь мы рассмотрим простой метод комбинирования ферментативный (коллагеназа, гиалуронидаза и DNAse) и механических переваривания мышиных сердца предшествует внутрисосудистого администрации дневно помечены антител к дифференцировать малые но неизбежным внутрисосудистые клеток загрязнений. Этот метод создает подвеска изолированных жизнеспособных клеток, которые могут быть проанализированы проточной цитометрии для идентификации, фенотипа и количественной оценки, или Далее очищенный с сортировки активирован флуоресценции клеток или разделения магнитный шарик для транскрипционный анализ анализ или в пробирке исследования. Мы включить пример анализа гранулярных пошаговые потока дифференцировать ключевых макрофаги и дендритные клетки населения сердца. Для среднего размера эксперимента (10 сердца) завершение процедуры требует 2-3 ч.
Introduction
Различные формы миокарда стресса или травмы, включая ишемического (ишемии-реперфузии или инфаркт миокарда) и не связанная с ИБС (гипертонии или миокардит), поощрять набор воспалительных клеток с репаративные и защитные, но и патогенные свойства. Еще в 1891 Ромберга впервые описал наличие клеточных инфильтратов в миокарде больных, инфицированных тифа и скарлатина1. Однако детальное изучение сердца иммунных клеток требует разработки методов более продвинутые Иммунофенотипирование. Как следствие только недавно мы начали понимать, что разнообразие населения иммунных клеток с важным поддержание роли при установившемся находится в миокарде.
Гистология был и до сих пор является наиболее распространенным методом характеризовать сердечной клетки иммунной системы во время воспаления. Однако хотя Гистологическая картина представляет собой ценный инструмент диагностики, его использование в изучении сердечной иммунных клеток имеет важные ограничения. Иммунные клетки, проживающих в миокарде представляют собой весьма незначительную часть общего числа клеток и более или менее равномерно распределены в пропорционально необъятный космос. Аналогично некоторые формы сердца воспаления, таких как вирусный миокардит, показывают координационных структур воспаления. Это означает, что точный анализ иммунной системы сердца часто требуют более высокой степени гистологической выборки, увеличивая стоимость снижения отклонений. Кроме того гистология обеспечивает очень ограниченное количество полезной информации в ячейки идентификации (например , количество параметров). С постоянно растущим числом подмножеств клеток, которые требуют использования нескольких маркеров выражение (в том числе поверхностных маркеров, факторы транскрипции или выделяется молекул) проточной цитометрии зарекомендовал себя как самый мощный инструмент для иммунофенотипирование, Благодаря низкой стоимости и высокой пропускной способности.
Использование методов Иммунофенотипирование тесно зависит от развития эффективного переваривания протоколов, разрешенных для одного клетки анализа большого числа клеток. Разработка исчерпывающие протоколы клетки добычи открыл новое окно возможностей в исследовании сердца иммунологии. Благодаря сочетанию пищеварение, проточной цитометрии и transcriptomics основных популяций макрофаги и дендритные клетки, проживающих в самом сердце были характерны2,3. Наиболее распространенным населения сердечной иммунных клеток во время устойчивого состояния являются CD64+MerTK+ макрофаги, которые могут быть далее разделены на основе их выражения CCR2 или CD11c2. CCR2+ макрофаги происходят от взрослого костного кроветворения, тогда как большинство из CCR2– макрофаги, которые выражают высокий или низкий уровень MHC-II, в основном дородовой происхождения. Макрофаги выполняют ключевые функции, такие как ремонт4 и удаления мусора5 во время травмы или поддержки электрические подключения6 в стационарном состоянии. Во время различных форм воспаления происходят важные приток Ly6CПривет MHC-IIЛо CD64int моноцитов, который позже дифференцироваться в Ly6CПривет CCR2+ макрофаги2,7 . Значительно меньше, но важно, популяция клеток, проживающих в миокарде здоровых людей состоит из дендритные клетки8,9. Два основных подмножества сердечной обычных DCs (cDCs) недавно характеризовались: cDC1 (CD103+ DCs) и cDC2 (CD11b+ DCs). РСУ играют важную роль в обороне против инфекции8 , но могут также способствовать самоповреждения во время воспаления, особенно во время инфаркта миокарда9.
Здесь мы опишем простой метод для изоляции жизнеспособных сердца иммунных клеток от мыши миокарда. Метод сочетает в себе ферментативные и механических пищеварение с фильтрацией клетки фильтр для того, чтобы получить одну ячейку подвеска, которая может быть проанализирована, или неразделимая, поток цитометрии сортировки или магнитный шарик обогащения. Точные измерения внесосудистой клеток миокарда требуют сердца перфузии для удаления возможных загрязнений из крови сердца microvasculature. Кроме того мы представляем необязательный шаг внутрисосудистого маркировки иммунных клеток, которые могут использоваться для дальнейшего дифференцировать миокарда клетки от внутрисосудистого загрязняющих веществ, основанный на Галкина et al. протокол10. Наконец мы представляем основной поток cytometry анализ для выявления основных субпопуляций макрофагов и cDC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Воспаление миокарда или миокардит, функция наиболее сердечно-сосудистых заболеваний. Однако миокард не лишена своих собственных иммунной компонентов в государствах, не болезнь. При устойчивом состоянии многие иммунные клетки находятся в миокарде и играть существенно важную роль под?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана канадской институтов медицинских исследований (148808 и 148792), SE был поддержан сердца и инсульта Фонда, персонала награду от администрация провинции Онтарио, марта Dimes, Тед Роджерс центр исследований сердца и Питер Мунк Сердечный центр. XCC проводит КНИИЗ Banting стипендий. LA проводит сердца и инсульта/Ричард Lewar студенчество премии.
Materials
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
Riferimenti
- Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. Pathology and natural history of human myocarditis. Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).
- Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
- Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
- Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. Cardioprotective function of cardiac macrophages. Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).
- Clemente-Casares, X., et al. A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis. Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).
- Van der Borght, K., et al. Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells. Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).
- Galkina, E., et al. Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung. Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).
- Edelson, B. T., et al. Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).
