Isolamento e identificação de células do sistema imunológico Extravascular do coração
Summary
Este protocolo apresenta um método simples e eficiente de isolar, identificar e quantificar as células imunes que residem no miocárdio de ratos durante o estado estacionário ou inflamação. O protocolo combina digestão enzimática e mecânica para a geração de uma suspensão de célula única que pode ser mais analisada por citometria de fluxo.
Abstract
O sistema imunológico é um componente essencial de um coração saudável. O miocárdio é lar de uma população rica de subconjuntos de células imunes diferentes com compartimentalização funcional tanto durante o estado estacionário e diferentes formas de inflamação. Até recentemente, o estudo de células do sistema imunológico no coração exigido o uso da microscopia ou protocolos de digestão mal desenvolvidos, que forneceu suficiente sensibilidade durante inflamação grave, mas com confiança não foram capazes de identificam pequenas — mas chave — populações de células durante o estado estacionário. Aqui, vamos discutir um método simples que combina enzimática (colagenase, hialuronidase e DNAse) e digestão mecânica de corações murino precedidas pela administração intravascular de fluorescente etiquetado anticorpos para diferenciar pequenas mas inevitável contaminantes de célula intravascular. Este método gera uma suspensão de células viáveis isoladas que podem ser analisados por citometria de fluxo para identificação, fenotipagem e quantificação, ou ainda mais purificado com fluorescência-ativado da pilha classificação ou separação magnética do grânulo para estudos de análise ou em vitro transcricionais. Nós incluímos um exemplo de uma análise de cytometric do fluxo passo a passo para diferenciar o macrófago chave e populações de células dendríticas do coração. Para uma experiência de tamanho média (10 corações) a conclusão do procedimento requer 2 a 3 h.
Introduction
Diferentes formas de stress do miocárdio ou acidentes, inclusive isquêmica (reperfusão de isquemia ou infarto do miocárdio) e não-isquêmica (hipertensão ou miocardite), promover o recrutamento de células inflamatórias com reparadora e protetora, mas também Propriedades de patogenicidade. Logo em 1891, Romberg descrita pela primeira vez a presença de celulares se infiltra no miocárdio de pacientes infectados com tifo e febre escarlatina1. No entanto, o estudo detalhado de células do sistema imunológico cardíacas necessária ao desenvolvimento de técnicas mais avançadas de immunophenotyping. Como consequência, somente recentemente nós começaram a entender que uma população diversa de células do sistema imunológico com funções essenciais de manutenção durante o estado estacionário reside dentro do miocárdio.
Histologia tem sido e ainda é, o método mais comum para caracterizar pilhas imunes cardíacas durante a inflamação. No entanto, enquanto histologia representa uma valiosa ferramenta de diagnóstico, sua utilização no estudo de células do sistema imunológico cardíacas tem limitações importantes. As células imunitárias que residem no miocárdio representam uma proporção muito pequena das células totais e são mais ou menos uniformemente distribuídas em um espaço proporcionalmente imenso. Da mesma forma, várias formas de inflamação cardíaca, tais como miocardite viral, apresentam padrões focais de inflamação. Isto significa que uma análise precisa do sistema imunológico do coração muitas vezes exige graus mais elevados de amostragem histológica, aumentando o custo para reduzir o preconceito. Além disso, a histologia fornece uma quantidade muito limitada de informações utilizáveis na identificação de células (por exemplo, o número de parâmetros). Com um número sempre crescente de subconjuntos de célula que exigem o uso de vários marcadores de expressão (incluindo os marcadores de superfície, fatores de transcrição ou moléculas secretadas), citometria de fluxo estabeleceu-se como a ferramenta mais poderosa para immunophenotyping, devido ao baixo custo e alta produtividade.
O uso de técnicas de immunophenotyping é estreitamente dependente do desenvolvimento de protocolos de digestão eficiente que permitiu para análise de single-células de um grande número de células. O desenvolvimento de protocolos exaustivos de extração de célula aberta uma nova janela de oportunidades no estudo da imunologia cardíaca. Através da combinação de digestão, citometria de fluxo e transcriptomics, as grandes populações de macrófagos e células dendríticas, que reside no coração foram caracterizadas2,3. A população mais abundante de células do sistema imunológico cardíacas durante estado estacionário são CD64+MerTK+ macrófagos, que podem ser divididos com base na sua expressão de CCR2 ou CD11c2. CCR2+ macrófagos originam hematopoiese adulta da medula óssea, Considerando que a maioria dos CCR2– macrófagos, que podem expressar os níveis de altos ou baixos de MHC-II, são principalmente de origem pré-natal. Os macrófagos funções chave como reparo4 e remoção de detritos5 durante lesão ou suportando conectividade elétrica6 em estado estacionário. Durante diferentes formas de inflamação ocorrer um afluxo importante de Ly6COi MHC-IIEis CD64int monócitos, que mais tarde se diferenciar em Ly6COi CCR2+ macrófagos2,7 . Uma população significativamente menor, mas importante, de células que residem no miocárdio de indivíduos saudáveis é composta de células dendríticas8,9. Recentemente foram caracterizados os dois subconjuntos principais de DCs convencionais cardíacas (conjuntos): cDC1 (CD103+ DCs) e cDC2 (CD11b+ DCs). DCs desempenham um papel importante na defesa contra infecção8 mas também podem promover a auto-lesão durante a inflamação, particularmente durante o infarto do miocárdio9.
Aqui, descrevemos um método simples para o isolamento das células imunes cardíacas viáveis de miocárdio de rato. O método combina digestão enzimática e mecânica com uma filtração de célula-filtro para obter uma suspensão de célula única que pode ser analisada, ou ainda mais purificada, pela classificação de citometria de fluxo ou enriquecimento magnética do grânulo. Medições precisas de células do miocárdio extravascular necessitam de perfusão cardíaca para remover possíveis contaminantes da corrente sanguínea da microvasculatura cardíaca. Além disso, apresentamos um passo opcional de rotulagem intravascular de células do sistema imunológico que podem ser usadas para diferenciar ainda mais as células do miocárdio de contaminantes intravasculares, com base no protocolo et al Galkina10. Finalmente, apresentamos uma análise de citometria de fluxo básico para identificar as principais subpopulações de macrófagos e cDC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inflamação do miocárdio ou miocardite, é uma característica das doenças cardiovasculares mais. No entanto, o miocárdio não é desprovida de seus próprios componentes imunes nos Estados de não-doença. Durante o estado estacionário, muitas células do sistema imunológico residem no miocárdio e desempenham o papel essencial de manutenção e proteção. A caracterização dessas diversas populações de células não teria sido possível sem métodos como o apresentado neste protocolo.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo canadense institutos de pesquisa em saúde (148808 e 148792), SE foi apoiado por um coração e Stroke Foundation, o prêmio do pessoal do escritório Provincial de Ontário, March of Dimes, Ted Rogers Centre para a investigação de coração e o Peter Munk Centro cardíaco. Xavier possui um CIHR Banting Fellowship. LA tem um coração & Stroke/Richard Lewar Studentship Award.
Materials
| Phosphate buffered saline | Wisent | 311-010-CL | 1x PBS |
| 21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle | BD | 305167 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Wisent | 311-511-CL | 1x HBSS |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Bovine serum | Sigma | B9433 | |
| 0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid | BioShop | EDT111 | |
| Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50 | Sarstedt | 83.1823.001 | |
| 28G 1/2 1 cc insulin syringe | BD | 329424 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Wisent | 319-005-CL | 1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate |
| Collagenase I | Sigma | C0130 | from Clostridium histolyticum |
| Hyaluronidase type I-S | Sigma | H3506 | |
| DNase-I | Sigma | D4513 | from bovine pancreas |
| Cell strainer, 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer | Lonza | 10-546E | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b | Biolegend | 101222 | 1:250 dilution |
| APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c | Biolegend | 128025 | 1:250 dilution |
| APC anti-mouse CD103 | Biolegend | 121414 | 1:250 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c | Biolegend | 117334 | 1:250 dilution |
| PE anti-mouse Ly-6G | Biolegend | 127607 | 1:250 dilution |
| Pacific Blue anti-mouse I-Ab | Biolegend | 116422 | 1:250 dilution |
| FITC anti-mouse CD64 (FcgRI) | Biolegend | 139315 | 1:250 dilution |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103113 | 1:250 dilution |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103132 | 1:40 dilution |
| TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| True-Stain Monocyte Blocker | Biolegend | 426101 | 1:20 dilution |
| FlowJo V10 | TreeStar Inc | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | |
| Mouse: Batf3-/- | The Jackson Laboratory | JAX: 013755 |
Riferimenti
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