Questo protocollo descrive un metodo per la coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans su terreni solidi. Come alternativa alla coltura liquida, questo protocollo permette di ottenere parametri di diverse scale sotto la piastra-base di coltivazione. Questo aumenta la comparabilità dei risultati omettendo le differenze morfologiche e metaboliche tra cultura mediatica di liquidi e solidi.
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Articolo metodologico
Piastra-base di coltivazione su larga scala di Caenorhabditis elegans: preparazione del campione per la studio di alterazioni metaboliche nel diabete
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La coltura di Caenorhabditis elegans (c. elegans) in maniera su larga scala su piastre di agar possa essere che richiede tempo e difficile. Questo protocollo descrive un metodo semplice e poco costoso per ottenere un gran numero di animali per l'isolamento delle proteine di procedere con ulteriori analisi proteomica, spettrometria di massa o un western blot. Inoltre, un aumento dei numeri del nematode per immunostainings e l'integrazione delle analisi multiple sotto le stesse condizioni di coltura può essere raggiunto facilmente. Inoltre, un trasferimento tra piastre con differenti condizioni sperimentali è facilitato. Tecniche comuni nella cultura piastra coinvolgono il trasferimento di un singolo c. elegans utilizzando un filo di platino e il trasferimento di agar popolate pezzi usando un bisturi. Tuttavia, con l'aumento del nematode numeri, queste tecniche diventano eccessivamente lunghe. Questo protocollo descrive la coltura su grande scala di c. elegans compresi i numerosi passaggi per ridurre al minimo l'impatto della preparazione del campione sulla fisiologia del worm. Fluido e shear stress può modificare la durata di vita e processi metabolici in c. elegans, richiedendo così una descrizione dettagliata delle fasi critiche al fine di recuperare risultati affidabili e riproducibili. C. elegans è un organismo modello, costituito da cellule di un neurone per fino a un terzo, ma in mancanza di vasi sanguigni, fornendo così la possibilità di indagare esclusivamente alterazioni neuronali indipendente di controllo vascolare. Recentemente, neurodegenerazione precoce nella retinopatia diabetica è stata trovata prima di alterazioni vascolari. Così, c. elegans è di particolare interesse per lo studio di meccanismi generali delle complicazioni diabetiche. Ad esempio, una formazione aumentata di glycation prodotti finiti avanzati (età) e specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono osservata, che si trovano in modo riproducibile in c. elegans. Protocolli di gestire campioni di dimensioni adeguate per uno spettro più ampio di indagini sono presentati qui, esemplificato dallo studio delle alterazioni biochimiche indotte da diabete. In generale, questo protocollo può essere utile per gli studi che richiedono grande c. elegans numeri e nella quale coltura liquida non è adatta.
Introduzione
Analisi di proteine, come una macchia occidentale o spettrometria di massa, richiedono milligrammi di proteine. Questo rendimento richiede una coltura su grande scala delle centinaia di c. elegans, che possono essere compiute in coltura liquida o in terreni solidi trasferendo i nematodi mediante lavaggio. Fluido e shear stress induce l'espressione di canali epiteliale del sodio (ENaC), che potrebbe aumentare lo stress osmotico attraverso un maggiore assorbimento di sodio, potenzialmente alterare la durata della vita di c. elegans e che interessano analisi metaboliche1 . Di conseguenza, alcuni passaggi critici nel presente prot....
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Protocollo
Nota: Questo protocollo è diviso in cinque sezioni. Punti 1-3, è presentato il protocollo principale alla cultura c. elegans a larga scala. Sezioni 4 e 5 forniscono ulteriori protocolli per la valutazione dei metaboliti esemplificati che accadono in metaboliti diabetiche. In dettaglio, sezione 1 descrive una cultura generale su larga scala sulle piastre. Sezione 2 si concentra sul trasferimento di grandi quantità di c. elegans, considerando che la sezione 3 spiega la raccolta di un campione su larga scala. Sezione 4 spiega l'isolamento della proteina dal campione e sezione 5 descrive la preparazione dei campioni per le analisi successive liquido crom....
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Risultati
Qui esempi di creazione di una larga scala di c. elegans della coltura per applicazioni nella ricerca del diabete sono presentate. Può essere di interesse per correlare i parametri di un singolo animale, piuttosto che per normalizzare e alla concentrazione di proteine totali. In un'analisi che richiedono un piccolo numero di nematodi, questo può essere facilmente realizzata contando i nematodi. Per una larga scala di c. elegans cultura coinvolgendo centinaia di nematodi .......
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Discussione
Questo protocollo presenta un metodo affidabile per la coltura su grande scala di c. elegans per ottenere risultati quantitativi. I risultati dalla letteratura possono essere replicati come mostrato nei Risultati di rappresentante. Anche se questo protocollo per la raccolta di campioni su larga scala di c. elegans sembra un metodo semplice, ci sono certe insidie di prendere in considerazione. Per quanto riguarda la sincronizzazione della popolazione del nematode, questo protocollo descr.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) entro il 1874 IRTG "Complicazioni microvascolari diabetiche" e CRC 1118 "Metaboliti reattivi come causa per le complicazioni diabetiche tarda". Ceppi di c. elegans N2 e CL2166 sono stati forniti da CGC, che è finanziato dall'ufficio NIH di programmi di ricerca dell'infrastruttura (P40 OD010440).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| E. coli OP50 | CGC | n/a | |
| C. elegans N2 | CGC | n/a | |
| C. elegans CL2166 | CGC | n/a | |
| Piastra di Petri, 60 mm x 15 mm | Greiner One | 628161 | |
| Pipetta volumetrica, vetro, 10 mL | Neolab | E-0413 | |
| Proteinasi compresse da cocktail inibitore | Roche | 04693124001 | |
| Tampone lisato non denaturante: | |||
| Tris-HCl, pH 8 | Sigma | T3253 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma | S7653 | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma | E5391 | |
| Piastre a 96 pozzetti, fondo trasparente | Marca | 781611 | |
| Infinite M200, lettore di piastre | Tecan | 30017581 | |
| Perle di ossido di zirconio, 0,5 mm | Next advance | ZROB05-RNA | |
| Bullet Blender, omogeneizzatore | Next advance | BBX24 | |
| Pepsina dalla mucosa gastrica suina | Sigma | P6887 | |
| Timolo | Sigma | T0501 | |
| Pronasi E / Proteasi da Streptomyces griseus | Sigma | P6911 | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Sigma | P43339 | |
| Prolidasi da rene suino | Sigma | P6675 | |
| Aminopeptidasi da Aeromonas proteolytica | Sigma | A8200 | |
| Unità di filtro centrifuga Amicon Ultra-0.5 | Merckmillipore | UFC501096 | |
| I materiali di base per la coltura su piastre sono descritti nel riferimento 6. |
Riferimenti
- Fronius, M., Clauss, W. G. Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you. Pflügers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: ht....
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Ristampe e permessi
