Summary
Ændringer i kynurenine vej (KP) neuroactive metabolitter er impliceret i psykiatriske sygdomme. Undersøge de funktionelle resultater i en ændret kynurenine pathway stofskifte- vivo i gnavere kan hjælpe med at belyse roman terapeutiske tilgange. Den nuværende protokol kombinerer biokemiske og adfærdsmæssige tilgange for at undersøge virkningen af en akut kynurenine udfordring i rotter.
Abstract
Kynurenine vej (KP) af tryptophan nedbrydning har været impliceret i psykiatriske lidelser. Specifikt, astrocyte-afledte metabolit kynurenic syre (KYNA), en antagonist på begge N-methyl-d-aspartat (NMDA) og α7 nicotinsyre acetylcholin (α7nACh) receptorer, har været impliceret i kognitive processer i sundhed og sygdom. Som KYNA niveauer er forhøjede i hjernen hos patienter med skizofreni, er en fejlfunktion på glutamatergic og kolinerge receptorer menes at være kausalt relateret til kognitiv dysfunktion, en core domæne af psykopatologi af sygdommen. KYNA kan spille en pathophysiologically betydelig rolle hos personer med skizofreni. Det er muligt at ophøje endogene KYNA i gnavere hjernen ved at behandle dyr med direkte bioprecursor kynurenine, og prækliniske undersøgelser på rotter har vist, at akutte stigninger i KYNA kan påvirke deres indlæring og hukommelse processer. Den nuværende protokol beskriver denne eksperimentelle tilgang i detaljer og kombinerer en) en biokemisk analyse af kynurenine i blodet og hjernen KYNA dannelse (ved hjælp af high-performance væskekromatografi), b) adfærdsmæssige test for at sonde den hippocampus-afhængige kontekstuelle hukommelse (passiv undgåelse paradigme), og c) en vurdering af søvn-vågne opførsel [telemetric recordings kombinerer elektroencefalografi (EEG) og electromyogram (EMG) signaler] i rotter. Tilsammen en sammenhæng mellem forhøjet KYNA, søvn og kognition er studeret, og denne protokol beskriver i detaljer en eksperimenterende tilgang til forståelsen af funktionen resultater af kynurenine højde og KYNA dannelse i vivo i rotter. Resultater, der opnås gennem variationer af denne protokol vil teste hypotesen at KP og KYNA tjene centrale roller i modulerende søvn og kognition i sundhed og sygdom stater.
Introduction
KP er ansvarlig for nedværdigende næsten 95% af den essentielle aminosyre tryptophan1. I pattedyr hjernen metaboliseres kynurenine tages astrocytter i neuroactive lille molekyle KYNA primært af enzymet kynurenine aminotransferase (KAT) II2. KYNA fungerer som en antagonist på NMDA og α7nACh receptorer i hjernen2,3,4, og også mål signalering receptorer herunder aryl kulbrinte receptor (AHR) og G-protein koblet receptor 35 (GPR35)5 ,6. I forsøgsdyr, har stigninger i hjernen KYNA vist sig at forringe deres kognitive præstationer i en række adfærdsmæssige assays2,7,8,9,10 . En spirende hypotese foreslår, at KYNA spiller en integrerende rolle i modulerende kognitive funktioner af påvirker søvn-vågner adfærd11, dermed yderligere understøtte rollen, som astrocyte-afledte molekyler i modulerende neurobiologi af søvn og kognition12.
Klinisk, er stigninger i KYNA blevet fundet i cerebrospinalvæsken og post mortem hjernevæv fra patienter med skizofreni13,14,15,16, en invaliderende psykiatrisk lidelse karakteriseret ved kognitive funktionsnedsættelser. Patienter med skizofreni er også ofte plaget af søvnforstyrrelser, der kan forværre sygdom17. Forståelse af KP metabolisme og KYNA rolle i modulerende en sammenhæng mellem søvn og kognition, især mellem indlæring og hukommelse, kan føre til udvikling af nye terapier til behandling af disse dårlige resultater i skizofreni og andre psykiatriske sygdomme.
En pålidelig og ensartet metode til måling af KP metabolitter er vigtigt at sikre, at forskningen kommer fra forskellige institutioner kan integreres i den videnskabelige forståelse af KP biologi. I øjeblikket, beskrive vi metoden til at måle kynurenine i rotte plasma og KYNA i hjernen, rotte af high-performance væskekromatografi (HPLC). Denne protokol, som gør brug af en fluorimetri påvisning i overværelse af Zn2 +, blev først udviklet af Shibata18 og mere for nylig tilpasset og optimeret til at derivatize med 500 mM zink acetat som efter kolonne reagens, giver mulighed for påvisning af endogene, nanomolar mængder KYNA i hjernen11.
For at stimulere de novo endogene KYNA produktion, som beskrevet i denne protokol, sprøjtes direkte bioprecursor kynurenine intraperitoneal (i.p.) i rotter. I kombination med biokemiske vurderinger for at bestemme graden af KYNA produktion, virkningerne af en kynurenine udfordring på Hippocampus-afhængige hukommelse (passiv undgåelse paradigme) og søvn-vågner arkitektur (EEG- og EMG signaler) er også undersøgte11. En kombination af disse metoder giver mulighed for undersøgelse af de biokemiske og funktionelle konsekvenser af en kynurenine udfordring i vivo i rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vores eksperimentelle protokoller blev godkendt ved University of Maryland institutionelle dyrs pleje og brug udvalget og fulgte den National Institutes of Health's Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
Bemærk: Voksne mandlige Wistar rotter (250-350 g) blev brugt i alle eksperimenter. Separat kohorter af dyr blev brugt til biokemiske analyser, adfærdsmæssige eksperimenter og søvn-vågner optagelser. Dyrene har været opstaldet i en temperatur-kontrolleret facilitet på Maryland psykiatriske Research Center. De blev holdt på en 12/12 h lys-mørke cyklus, med lys i zeitgeber tid (ZT) 0 og lys slukket på ZT 12. Dyrene fik ad libitum adgang til mad og vand under forsøgene. Anlægget var fuldt akkrediteret af American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care.
1. intraperitoneal Kynurenine Administration til rotter
Bemærk: I denne protokol, kynurenine blev administreret på ZT 0 (begyndelsen af den lette fase) og væv blev indsamlet på ZT 2 og ZT 4 til at bestemme et tidsforløb for kynurenine stofskifte. Saltvand-indsprøjtning dyr blev brugt som et kontrolelement. For eksempel, hvis en rotte vejer 500 g og den ønskede dosis er 100 mg/kg, bør rotten modtage en 5 mL injektion af 10 mg/mL opløsning af kynurenine.
- Afvejes L-kynurenine sulfat ("kynurenine") og læg det i en 20 mL hætteglas. Sørg for at holde kynurenine på is på alle tidspunkter.
-
Tilføje saltvand for at opnå den ønskede koncentration og pH-værdien til 7,6 ved hjælp af 1 N natriumhydroxid (NaOH). Vortex og Læg instrumenterne i ultralydsbad løsningen indtil kynurenine er opløst helt.
Forsigtig: Følg alle henstilling forholdsregler under håndtering NaOH.- For eksempel, for at opnå en 10 mg/mL opløsning, 200 mg af kynurenine afvejes og anbringes i et hætteglas. Der tilsættes 15 mL saltvand og vortex og Rens med ultralyd (20 kHz til 5 – 10 s, 1/8 tommer diameter microtip) det til at opløse. Bruge NaOH, justere pH af løsningen. Endelig, bruge saltvand til at justere lydstyrken til 20 mL.
- Vejer hver eksperimentel rotte og beregne volumen af hver injektion baseret på dyrets kropsvægt og ønskede behandling dosis. Forsigtigt fjerne dyret fra sit hjem bur, injicere løsningen intraperitoneal, og returnere dyret til sit bur.
2. Kynurenine målinger ved hjælp af High-performance væskekromatografi
- Væv samling
Bemærk: I denne protokol, kynurenine blev administreret på ZT 0 (begyndelsen af den lette fase) og væv blev indsamlet på ZT 2 og ZT 4 til at bestemme et tidsforløb for kynurenine stofskifte. Saltvand-indsprøjtning dyr blev brugt som et kontrolelement.- Bruge kuldioxid til at aflive dyret. Efter tegn på respiration er ophørt for 1 min, udføre en sekundær aktiv dødshjælp metode ved halshugning.
- For at indsamle blod for hele stammen, placere en engangs tragt ind i en 15 mL rør indeholdende 20 μL af K3-EDTA (0,5 M). Tillad blodet at løbe fra kroppen ind i røret. Vend røret flere gange for at sikre EDTA er blandet i hele.
- Brug saks, skåret huden på toppen af hovedet ned midterlinjen at eksponere kraniet. Fjern eventuelle overskydende hals muskel på bagsiden af kraniet og ved åbningen til rygmarven, skære igennem kraniet fra tilbage til forsiden.
- Træk forsigtigt de to sider af kraniet åbent at afsløre hjernen, og derefter forsigtigt fjerne hjernen med pincet for ikke at beskadige den. Fjern de olfaktoriske pærer med et barberblad og skære hjernen i halvdelen ned midterlinjen. Brug af pincet, dissekere hemibrain i regioner af interesse (dvs., hippocampus og cortex).
- Placere alle dissekeret hjernen stykker på aluminiumsfolie på tøris. Når vævet er helt frosset, overføre det til en 20 mL plastik hætteglas og opbevar den ved-80 ° C.
- Der centrifugeres hele stammen blod på 300 x g i 10 min. Fjern supernatanten (plasma) og overføre det til nye centrifugeglas før gemme dem ved-80 ° C.
- Forberedelse af prøver
- Plasma: indsamlet fra behandlede dyr
- Optø frosne rør med plasma (Se trin 2.1 for samlingen væv) på våd is.
- I en ny centrifugeglasset, fortyndes prøven med ultrarent vand (1:2 kynurenine, 1:10 for KYNA). Til 100 μl af de fortyndede prøve, tilsættes 25 μL 6% perchlorsyre.
Forsigtig: Følg alle henstilling forholdsregler under håndtering perchlorsyre. - Vortex alle prøver, derefter centrifugeres dem på 12.000 x g i 10 min. Når først færdig, fjerne 100 μL af supernatanten (fra hver tube) og placere dem i en lille 0,25 mL microcentrifuge tube til kynurenine eller KYNA bestemmelse.
- Hjerne: indsamlet fra behandlede dyr
- Sted rør med frosne hjernen prøver (Se trin 2.1 for samlingen væv) på tøris. Individuelt veje hver hjerne prøve på en præcis Analysevægt. Tilbage til røret og læg det tilbage på tøris.
- Når alle prøver er blevet afvejet, flytte rørene ind på våde is. Fortynd hver stikprøve 1:10 w/v med ultrarent vand og omrystes dem ved hjælp af en sonikator (20 kHz til 5 – 10 s, 1/8 tommer diameter microtip). For eksempel, for 100 mg af hjernevæv, tilføje 900 μl ultrarent vand.
- Alikvot 100 μL af hver fortyndet prøve til en ny tube og surt det med 25 μL af 25% perchlorsyre. Vortex, derefter centrifugeres det på 12.000 x g i 10 min.
- Efter centrifugering, fjerne 100 μL af supernatanten og læg det i små 0,25 mL microcentrifuge rør til KYNA bestemmelse.
- Plasma: indsamlet fra behandlede dyr
- HPLC set-up og Kør
- Forberede 50 mM natrium acetat Mobil fase. 6.81 g natrium acetat trihydrat i 1 L ultrarent vand opløses. PH indstilles til 6.2 ved hjælp af iseddike og derefter vakuum filtreres det i rene glasvarer. Overføre natrium acetat Mobil fase til en ren 1 L glasflaske.
- Forberede 500 mM zink acetat. Opløses 54.88 g af zink acetat i 500 mL i ultrarent vand, og derefter vakuum filtrere den. Overføre det til en ren 500 mL glasflaske. Udfylde en 1 L flaske med ultrarent vand og en 500 mL flaske med HPLC grade acetonitril.
- Placer indtag slangen fra HPLC maskinen separat i den mobile fase, den ultrarent vand og 100% acetonitril. Pumpe zink acetat løsning separat gennem en peristaltisk pumpe, der kombinerer med den mobile fase efter kolonne, og inden for forædling.
- Brug af betjeningspanelet på maskinen, programmere den til at køre 5% acetonitril og 95% ultrarent vand på 0,5 mL/min. lad det køre i 20 – 30 min til at opnå en stabil pres og baseline.
- Ved etablering af en stabil basislinje, ændre løsning komposition til 5% acetonitril og 95% natrium acetat Mobil fase. Blandingen henstår i 30 min.
- Tænd lampen i fluorescens detektor og gør det muligt at varme op.
- I mellemtiden også tænde efter kolonne pumpen til en gennemstrømningshastighed på 0,1 mL/min. Tillad det at nå frem til et stabilt tryk på omkring 500 psi efter ca 20 min.
- Forberede standarderne.
- For KYNA, begynder med en 1 mM stamopløsning og fortyndes for at forberede 5 standard koncentrationer (dvs.10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1 nM og 500 pM).
Bemærk: Dette vil producere en standardkurve spænder fra 200 fmoles til 10 fmoles pr. 20 μL injektion. - For kynurenine, begynder med en 1 mM stamopløsning og fortyndes for at forberede 5 standard koncentrationer (dvs.10 μM, 5 μM, 2,5 μM, 1 μM og 500 nM).
Bemærk: Dette vil producere en standardkurve spænder fra 200 pmoles til 10 pmoles pr. 20 μL injektion.
- For KYNA, begynder med en 1 mM stamopløsning og fortyndes for at forberede 5 standard koncentrationer (dvs.10 nM, 5 nM, 2,5 nM, 1 nM og 500 pM).
- Opsætning af HPLC systemsoftware til at styre prøve sekvens parametre og mulighed for autoinjections af flere prøver.
- Når skærmbilledet "Kør prøve" Klik på "File" og træk til "Opret ny Eksempelsæt". Når det nye vindue åbner, Vælg "Tomt". Individuelt liste alle standarder (Se trin 2.3.8) eller prøver i den rækkefølge, de skal køres.
- I kolonnen "Funktion" udpege de standarder og prøver. Standarderne bør analyseres i begyndelsen og slutningen af sekvensen. Injicere vand mellem hver 5 prøver.
- Angiv operationstiden for hver prøve til 15 min. indsprøjtes 20 μL af prøven fra standarderne og plasma forberedelse eller indsprøjtes 30 μL af prøven fra hjernen homogenatet forberedelse.
- Indstille excitations- og bølgelængder (afhængigt af den sammensatte bliver vurderet) for kynurenine til magnetisering: 365 nm, emission: 480 nm, og retentionstiden: ~ 6 min, og for KYNA til magnetisering: 344 nm, emission: 398 nm, og retentionstiden: ~ 11 min.
- Når alle parametre er blevet sat og maskinen har ekvilibreres, køre sekvensen.
- For at kvantificere data, navigere til skærmbilledet "Gennemse projekt". Under fanen "Prøve sæt" Dobbeltklik på eksemplet sat til kvantificeres. Fra listen over alle injektioner, fremhæve alle standarder og højreklik. I det nye vindue, Vælg "Proces", så bruge drop-down menuen vælge "Kalibrere og kvantificere" ud for "Hvordan":.
- Fremhæv alle standarder igen, højreklik og vælg "Review". Når kromatogrammer åbner, brug knapperne øverst til at "Integrere" og derefter "kalibrere" hver standard; Dette vil automatisk oprette standardkurven.
- Vende tilbage til fanen "Prøve sæt" og dobbeltklik på prøve-sæt. Næste, fremhæve alle standarder. Gentag processen anført ovenfor, men i stedet, at vælge "Quantitate" fra drop-down menuen. Fremhæv alle prøver igen, så højreklik og vælg "Review". Når kromatogrammer åbner, bruge knapperne øverst til "Integrer" og derefter "Kvantificere" hver prøve.
Bemærk: Dette vil output koncentrationen af hver prøve, baseret på den tidligere oprettede standardkurven.
3. passive undgåelse paradigme
Bemærk: Disse adfærdsmæssige eksperimenter blev designet baseret på vores biokemiske fund med akut kynurenine udfordring. For at maksimere en forøgelse af hjernens KYNA, blev kynurenine (100 mg/kg) administreret på ZT 0, 2 h før træningen i den passive undgåelse paradigme til at teste hippocampus-medieret læring, der fandt sted på ZT 2. Apparatet består af 2 lige store rum (21,3 cm høj, 20,3 cm bred og 15,9 cm dyb) adskilt af en guillotine dør og indeholdt i en lydisolerede boks. De to rum af den testapparater benævnes "lys side" og "mørke side". Væggene i lyset side er klar, og under retssager, en lys vil tænde for yderligere belyse dette rum. Væggene i det mørke rum er helt dækket for at opretholde en black-out tilstand.
-
Dag 1: uddannelse retssag
- Inden prøvningen, rene apparat med 70% ethanol.
- Bringe dyr til test værelse.
- Forsigtigt placerer det eksperimentelle dyr til lyset side af apparatet og tæt og låsen apparater døren og boksen lydisolerede.
- Ved hjælp af det tilknyttede programmel, Begynd forsøget. Fra startskærmbilledet skal du vælge "File" og derefter "Åbn Session" fra drop-down menuen. I det nye vindue, sikre den korrekte procedure og apparater, der er valgt, og klik på "Luk". Næste, Vælg "Konfigurer" og derefter "Signaler". I det nye vindue, Vælg den korrekte apparater og klik på "Problem".
Bemærk: Softwaren vil indlede et lys at tænde i lyset side af apparatet og åbne guillotine dør mellem de to rum. En timer vil blive indledt. - Når dyret fuldt ud træder den mørke side af apparatet, guillotine døren vil lukke, og en uundgåelig fod chok (0,56 mA for 1 s) vil blive leveret.
- Registrere den tid, der er forløbet før dyret gik ind i det mørke rum.
- Efter at dyret har modtaget chokket, tillader 30 s opsving tid før at fjerne dyret fra apparatet.
- Sted den animalske tilbage i sit hjem bur.
- Før du begynder forsøget med det næste dyr, tør apparat ren med et vådt håndklæde og bortskaffe enhver fækal pellets.
- Efter at alle dyr er blevet uddannet, bringe dem tilbage til det animalske facilitet.
-
Dag 2: test retssag
- Bringe dyr tilbage i den test værelse 24 timer efter uddannelse retssag. Begynde test retssagen for det første dyr ved at placere det i lyset side af apparatet, lukning og lagres døren og boksen lydisolerede.
- Indlede test retssagen ved hjælp af kommandoerne samme software som den foregående dag; lyset tændes i lyset side af apparatet og vil åbne guillotine dør mellem de to rum. En timer vil blive indledt.
- Når dyret ind i det mørke rum, vil guillotine døren lukke. Registrere tiden gået.
Bemærk: Retssagen vil blive opsagt via softwaren efter højst 300 s hvis dyret er stadig på den lyse side af den testapparater. - Placer den dyr tilbage i deres hjem bur og Rengør apparatet (som beskrevet i trin 3.1.9) før du begynder forsøget med det næste dyr.
4. sleep analyse
- Kirurgisk implantation af en trådløs EEG/EMG sender
Bemærk: De telemetric sendere bør steriliseret og udarbejdet forud for operationen.- Bruge et barberblad, forsigtigt fjerne en lille længde af plastmateriale til at afsløre ledningen fører. Placer senderne i en 50 mL konisk rør fyldt med sterilisering løsning [fxWavecide (2,65% glutaraldehyd)].
- Forlade senderne i den desinficerende opløsning i mindst 12 timer. Derefter, forud for kirurgi, overføre løsningen til en spildbakken. Skyl senderen med sterilt saltvand.
- På dagen for operationen, veje dyr før placere det i en anæstesi-afdeling. Fremkalde 3 – 5% isofluran med 100% O2.
- Efter en vellykket anæstesi, fjerne dyret og omhyggeligt barbering, ved hjælp af en elektrisk barbermaskine, toppen af hovedet og hals, samt et lille plaster på hår på bagsiden af kroppen, bare lidt til venstre og under brystkassen.
- Administrere carprofen (5 mg/kg) subkutant til postoperativ analgesi.
- Placere et Termostatstyret varme-vand varmepude sat til 37 ° C under dyret at bevare dyrets kropstemperatur under operationen.
- I et stereotaxisk ramme, skal du placere dyret på en næsen kegle til at opretholde den bedøvende tilstand og placere øre barer for at stabilisere hovedet. Sterilisere glatbarberet huden ved vekslende svaberprøver af betadine krat og 70% ethanol. Anvende opthalamic salve på øjnene at smøre dem.
- For at sikre tilstrækkelig anæstesi før den første indsnit, bruge tå-knivspids test.
- Med en steril skalpel, gøre et snit fra lige bag øjnene ned til bagsiden af halsen. Kraniet og dorsale cervikal nakke muskler skal udsættes.
- Hvis det er nødvendigt at udsætte kraniet, bruge bomuld tippes applikatorer for at fjerne enhver membraner. Mikro-bulldog klemmer kan bruges til at holde huden væk fra kraniet. Find og Markér positionen af bregma. Bor 2 burr-huller og indsætte metal skruer 2,0 mm forreste / + 1,5 mm lateral og 7,0 mm bageste /-1,5 mm lateral i forhold til bregma. Komplet 2 omdrejninger til at stramme skruerne. Dække udsatte kraniet med et stykke gaze.
- Brug steril kirurgiske saks, gøre et snit ind i kroppens hulrum, lige under ribbenene.
- Sørg for at optage løbenummer af senderen til implanteres i arket kirurgisk.
- Indsæt den sterile transmitter inde i kroppens hulrum. Ledning fører bør stadig være uden for kroppen.
- Bruge resorberbare suturer for at sy musklen væggen, at sikre, at alle kundeemnerne er samlet til den ene ende af snittet.
- Fjerne gaze fra hovedet og løft huden lige under indsnittet. Køre et par lange sterile hemostats under huden fra head snit til snit i siden. Holde pres på huden for at minimere enhver skade.
- Når hemostats er synligt i nærheden af kroppen indsnit, klip en membran, der kan dække dem med kirurgisk saks og grab fire senderen fører med hemostats. Langsomt trække hemostats, således at ledningerne lå under huden og køre op til kraniet.
- Udpege som 2 fører vil blive forbundet til kraniet. Brug af pincet, forstå enden af en ledning med den ene hånd og lige under slutningen af plastovertraek med den anden. Trække på wiren indtil individuelle sløjfer kan kun udfærdiges.
- Stramt wrap udsatte wiren omkring en af de metal skruer 3 – 4 x. Når sikker, stramme skruen for at forhindre, at wiren optrevling og klip off enhver ekstra ledning. Gentag dette med andet bly og skrue.
- Træk begge EEG fører fra kroppen hulrum, så de sidder lunt mod kraniet.
- Brug dental cement til at dække skruer og kortikale kundeemner, at skabe en fælles landbrugspolitik over udsatte kraniet. Sikre, at ingen dental cement klæber til huden eller muskel og at ingen skarpe kanter er lavet. Tillad dental cementen tørre.
Bemærk: Fælles landbrugspolitik skal være lille nok, at huden kan være syet over toppen. - For EMG kundeemner, forstå slutningen af wire og plastovertraek som beskrevet i trin 4.1.15. Stræk ledning, indtil de enkelte sløjfer er tydeligt mærkbare.
- Køre en 22 G nål under nakke muskler i højre side for 2-3 mm før gør det muligt at komme ud. Bruger nonabsorbable suturer, placere en enkelt, løs sutur omkring den integrerede nål.
- Tråd EMG wire i nålen og træk nålen ud, så EMG ledning til tråden under musklen. Stramme sutur for at sikre ledningen forbliver på plads og klip ekstra ledning der kan opstå fra musklen.
- Gentag trin 4.1.20 og 4.1.21 for den anden EMG bly, ca 1 mm ned fra den første bly.
- Træk begge EMG fører fra kroppen hulrum, så de sidder lunt mod musklen.
- Bruge nonabsorbable masker for at lukke af hoved og hals indsnit. Guffe alle ekstra ledning under huden på kroppen og bruge sår clips til at lukke krop snit.
- Anvende lidocain salve til både snit websteder for at hjælpe dyr med postoperative smerter.
- Returnere dyret til sit hjem bur, så buret til at sidde på den hede afrivningsblok, indtil dyret har tilbagebetalt fra anæstesi.
Bemærk: Dyret skal inddrive for 7-10 dage før begyndelsen af optagelser.
- Bruge et barberblad, forsigtigt fjerne en lille længde af plastmateriale til at afsløre ledningen fører. Placer senderne i en 50 mL konisk rør fyldt med sterilisering løsning [fxWavecide (2,65% glutaraldehyd)].
- EEG/EMG optagelse
Bemærk: I denne protokol, vi administreres saltvand eller kynurenine på ZT 0 og derefter indspillede dyrets søvn-vågner mønstre i 24 timer.- Komplet alle søvn optagelser i et udpegede rum, hvor dyrene ikke vil blive afbrudt for varigheden af optagelsen.
- Placer burene af dyret (forsynet med indopereret EEG/EMG senderen) på en modtager enhed. Tænde indopereret senderen ved hjælp af en magnet.
Bemærk: En lys bør vises på modtageren enhed, når senderen er aktiveret. - Nedsat optagelse af EEG/EMG data ved hjælp af det tilknyttede programmel.
- Vælg "Eksperiment" og derefter "Create" fra drop-down menuen. Navngive eksperimentet, og derefter gemme den. Næste, Vælg "Hardware" og derefter "Rediger MX2 konfiguration".
- I det nye vindue, Vælg alle sendere anvendes i eksperimentet og angive, hvilke modtagende pad er parret med. Når du er klar, skal du starte optagelsen ved at trykke på "Start alle løbende".
- Ved ophør af eksperimenterne, Vælg "Stop alle løbende" i det tilknyttede programmel og slukke senderne ved hjælp af en magnet.
- Euthanize dyrene af CO2 kvælning efterfulgt af en hjerte punktering. Fjern senderen omhyggeligt ved genåbning indsnit langs toppen af hovedet med kirurgisk saks og skære fører gratis fra den dental cement og hals muskler.
- Dernæst åbne kroppen hulrum, lokalisere senderen og langsomt fjerner det fra kroppen.
- EEG/EMG analyse
- Bruge den tilhørende software til at analysere dataene, søvn-vågne. Åbn programmet og vælg "Tilføj ny placering". I det nye vindue, skal du vælge data til at importere det til den scoring software.
Bemærk: Dette vil skabe en ny fil i den software, der indeholder alle rå bølgeformer indsamlet under eksperimentet. - Manuelt score årvågenhed stater for de ønskede eksperimenter. Efter scoring, analysere parametre som den samlede varighed, antallet af anfald og gennemsnitlige bout varigheden af de forskellige årvågenhed stater [hurtige øjenbevægelser (REM), ikke - REM NREM og wake].
Bemærk: Analysen kan udføres over hele optagelsen eller forkortet til bestemt tid interessepunkter. Her, blev analysen udført for perioden optagelse mellem ZT 0 til ZT 2.
- Bruge den tilhørende software til at analysere dataene, søvn-vågne. Åbn programmet og vælg "Tilføj ny placering". I det nye vindue, skal du vælge data til at importere det til den scoring software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at godkende brugen af en intraperitoneal kynurenine injektion som en metode til at ophøje hjernen KYNA, blev en HPLC-analysen af væv udført. Standard kurver (figur 1) blev bygget ved hjælp af det tilknyttede programmel og tilladt for kvantificering af vævsprøver. Repræsentative kromatogrammer for kynurenine og KYNA er præsenteret i figur 2. Kynurenine blev observeret på en retentionstid på 6 min., og KYNA havde en retentionstid på 11 min. For at overholde KP dynamics, 100 mg/kg af kynurenine blev administreret i denne protokol, og væv blev indsamlet umiddelbart efter injektion, eller 2 eller 4 h efter injektion (figur 3a). Plasma kynurenine (figur 3b) og hippocampus KYNA (figur 3 c) blev kvantificeret. De specifikke parametre, der bruges i HPLC-bestemmelse af kynurenine metabolitter er skitseret i tabel 1. Dosis-responskurve produceret af denne protokol understøtter sin beskrivelse af en akut kynurenine injektion som en metode til at øge hjernens KYNA niveauer, med en top gennemføres på 2 timer efter injektion og niveauer af KYNA vendte tilbage til deres oprindelige 4 timer efter injektion.
Baseret på de ovennævnte biokemiske fund, blev uddannelse i den passive undgåelse paradigme udført 2 h efter kynurenine injektion (figur 4a). Ingen gruppe forskelle blev observeret under uddannelse retssagen (figur 4b). Under test retssagen vises kontroldyr en betydelig stigning i ventetid til at indtaste den mørke side, der angiver kontekstuel læring. Dyr injiceres med kynurenine på den foregående dag ikke display den samme stigning i latenstid, udviser et underskud i læring. Baseret på disse resultater, kan vi konkludere, at akut kynurenine højde, i tid af memory erhvervelse og konsolidering, resulterer i en forringet ydeevne i en hippocampus-medieret opgave.
For at undersøge virkningen af en akut kynurenine højde i den lette fase på søvn-vågner arkitektur, blev dyr sprøjtet med saltvand på dag 1 og med kynurenine på dag 2 på ZT 0 (figur 5a). EEG/EMG signaler blev indspillet telemetrically for perioden hele 48 h. Sammenligningerne blev foretaget mellem den saltholdige injektion (køretøj) på dag 1 og kynurenine indsprøjtningen på dag 2. Resultaterne viste en reduktion i total REM søvn varighed (præsenteret som en procentændring fra den oprindelige plan) i løbet af de første 2 h (figur 5b) efter en indsprøjtning. Dette var spejlet af en stigning i kølvandet varighed under disse perioder og en lille reduktion af NREM søvn. Disse resultater viser, at en akut kynurenine højde forårsager forstyrrelser i søvn-vågner dynamics.
Figur 1: Standard kurver for en kynurenine og KYNA injektion. 20 µL af hver standard blev sprøjtet for at oprette Standardkurven for (A) kynurenine og (B) KYNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative kromatogrammer for kynurenine og KYNA. Standarderne blev kørt før en prøve for at bekræfte deres retentionstider. Disse paneler viser repræsentative prøver for (A) serum kynurenine og (B) hjernen KYNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: analyse af serum og hippocampus væv af HPLC efter en kynurenine udfordring. (A) Kynurenine (100 mg/kg) eller saltvand blev administreret af en intraperitoneal injektion på zeitgeber tid (ZT) 0. Væv blev indsamlet enten 2 eller 4 timer efter injektion. De følgende paneler viser eksponering for (B) kynurenine-forhøjede serum kynurenine og (C) hippocampus KYNA niveauer 2 timer efter injektion. P < 0.001 angiver betydningen af en to-vejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af en Bonferroni t-test korrektion. N = 4-5 pr. gruppe. Alle data er gennemsnit ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra Pocivavsek et al. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: effekten af en kynurenine højde på Hippocampus-afhængige hukommelse i den passive undgåelse paradigme. (A) Kynurenine (100 mg/kg) eller saltvand blev administreret af intraperitoneal injektion på zeitgeber tid (ZT) 0. Dyrene blev uddannet på opgaven på ZT 2. 24 timer efter træning, dyrene blev testet for hukommelsen dannelse. (B) en eksponering for kynurenine før uddannelsen reduceret ventetid for at undgå den afskrækningsmiddel mørke rum på dagens test. P < 0,01, *** P < 0.001 angiver betydningen af en to-vejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af en Bonferroni t-test korrektion. N = 8-14 pr. gruppe. Alle data er gennemsnit ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra Pocivavsek et al. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: effekten af en kynurenine højde på søvn-vågner arkitektur. (A) saltvand (dag 1) og kynurenine (100 mg/kg, dag 2) blev administreret af en intraperitoneal injektion på zeitgeber tid (ZT) 0. Søvn-vågner adfærd blev indspillet for det efterfølgende 24 h. (B) hurtige øjenbevægelser (REM) søvn varighed blev reduceret og wake varighed blev forøget i de første 2 timer efter kynurenine injektion. P < 0,05 angiver betydningen af en to-vejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af en Bonferroni t-test korrektion. N = 6 – 8 pr. gruppe. Alle data er gennemsnit ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra Pocivavsek et al. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Mobil fase sammensætning | 50 mM natriumacetat, pH 6.2 |
| 5% acetonitril | |
| Mobil fase strømningshastighed | 0,5 mL/min |
| Efter kolonne forædling reagens | 500 mM zink acetat |
| Efter kolonne forædling strømningshastighed | 0,1 ml/min |
| Kolonnetype | ReproSil-Pur C18 |
| Kolonnedimensioner | 4 x 150 mm2 |
| Detektor temperatur | 4.0 ºC |
| Kynurenine bølgelængde | Ex: 365, Em: 480 |
| Kynurenine retentionstid | ~ 6 min |
| KYNA bølgelængde | Ex: 344, Em: 398 |
| KYNA retentionstid | ~ 11 min |
Tabel 1: Parametre for en HPLC-bestemmelse af kynurenine pathway metabolitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til en pålidelig vurdering af KYNA i hjernen efter en perifer kynurenine administration er det afgørende at kombinere og fortolke biokemiske og funktionelle eksperimenter. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol, der tillader nye brugere at etablere effektive metoder til måling af plasma kynurenine og hjernens KYNA af rotter. Måling af kynurenine i plasma bekræftet den nøjagtige injektion og måling af metabolitten KYNA bekræfter de novo -syntesen i hjernen. Der er flere fordele ved den beskrevne fluorometriske HPLC-metoden, tilpasset fra Shibata18, derivatize KYNA i nærværelse af Zn2 +, herunder muligheden for at netop afsløre endogene mængder af KYNA i hjernen i rækken nanomolar . Derudover er metoden blevet tilpasset til at opdage bioprecursor kynurenine i plasma i området micromolar ved at justere fluorometriske bølgelængder af excitations- og, som beskrevet i protokollen.
Kritiske trin i protokollen, såsom bestemte tidspunkter mellem behandling og eutanasi, er beskrevet præcist bestemme tiden for KYNA dannelse i hjernen og guide design og analyse af de adfærdsmæssige og søvn-vågner eksperimenter. Hippocampus-medieret læring blev vurderet ved hjælp af passive undgåelse paradigme og en søvn-vågner analyse blev foretaget med telemetric optagelser af EEG/EMG data. Da vi besluttede, at hjernen KYNA niveauer var højest 2 timer efter injektion, timet vi adfærdsmæssige paradigme træningspas i overensstemmelse hermed, således at anskaffelsen i passiv undgåelse opgave opstod, da KYNA var højest på ZT 2. Derudover fokuserede vi også analysen af søvn-vågne adfærd på den kritiske ZT 0 til ZT 2 gang indramme hvor KYNA niveauer var højest i hjernen. Tilsammen, har velovervejet forsøgets udformning tilladt os at bygge bro sammen resultater fra biokemiske og funktionelle eksperimenter, at indføre KYNA som en modulator både kognition og søvn-vågner adfærd11.
En række begrænsninger bør overvejes i den beskrevne protokol. For at stimulere endogen produktionen af KYNA, var direkte bioprecursor kynurenine injiceres perifert i rotter. Kynurenine passerer let blod - hjerne barrieren og stimuleret KP stofskiftet opstår i en bred vifte af hjernen regioner2. I øjeblikket fokuserer vi på elevation i astrocyte-afledte KYNA i hippocampus; Det er dog vigtigt at overveje at systemisk injektioner af kynurenine også ophøje metabolitter af den neurotoksiske gren af KP, herunder 3-hydroxykynurenine (3-HK) og quinolinsyre syre. For at drille hinanden effekter forårsaget af stigninger i 3-HK i forhold til dem, der forårsages af KYNA højder, skal metoden, der justeres. Derudover giver perfuse elevation i KP stofskifte i hele hjernen11 en begrænset indsigt i de specifikke hjerneregioner, der mægle ændringer i adfærd.
Når du udformer den adfærdsmæssige eksperiment beskrevet her, optimeret vi passiv undgåelse paradigme med hensyn til eksisterende metoder, som beskrevet i detaljer, at engagere hippocampus-medieret kontekstuelle hukommelse. Hukommelse består af tre store underprocesser: kodning, konsolidering og hentning. Optimale betingelser for hukommelse konsolideringsprocesser forekomme under søvn nyligt kodet hukommelse er integreret i langsigtede oplagring19,20. Som studier i gnavere har fokuseret på smalle tidsvinduer hukommelse konsolidering og identificeret hukommelsen vises mest følsomme, når søvn er forsinket efter overtagelsen, valgte vi at ophøje den kynurenine og KYNA dannelse i hjernen under denne følsomme tidsvindue, påvirker anskaffelsen og konsolidering, at teste hypotesen i denne artikel. Vi ikke, men i øjeblikket tester hvis hentning af hukommelsen var påvirket af kynurenine højder, som tidligere vist21. Det er kritisk vigtigt også overveje at hjernen regionerne deltager i gnavere til at udføre en opgave. For denne undersøgelse, vi var mest interesseret i rollen som hippocampus i modulerende kognition, ændringer i protokollen kan være nyttige til at teste dyr i alternative adfærdsmæssige paradigmer, der har vist sig at være påvirket af en akut kynurenine udfordring, såsom frygt conditioning og arbejder hukommelse opgaver2,7,8,9,10.
Desuden, i stedet for systemisk injektioner af kynurenine at ophøje hjernen KYNA, omfatter alternative strategier til at overveje de direkte infusion af KYNA i et område af interesse eller målrettet hæmning af syntese enzymet KAT II af farmakologiske værktøjer eller Molekylær knock-down tilgange i specifikke hjerneregioner, at teste mekanistiske hypoteser. Mens disse tilgange kan også indføre potentielt invasive procedurer, der uafhængigt påvirker de funktionelle resultater måles, er det afgørende at design eksperimenter med optimal kontrol betingelser.
Endelig, søvn optagelse EEG/EMG protokollen beskrevet her har fordelen at være telemetric i stedet for tøjret, afskaffelse af elektrisk støj, bevægelse artefakter og risikoen for skade i et dyr, der har trukket de tøjret kabler. Den fysiske størrelse og lette vægt af den telemetric enhed, og dets placering subkutant i stedet for intraperitoneal i rotten hen til optimere den postoperative genopretning, muliggør trådløs optagelser, at fange naturalistiske søvn-vågner adfærd med en gratis vifte af bevægelse. En vigtig overvejelse ved brug af telemetric systemet er dog den begrænsede evne til optagelse fra multipla kanaler samtidig. Den nuværende paradigme par EEG-kanalen og en EMG kanal, og giver mulighed for scoring af REM, NREM og wake adfærd.
Kombinationen af metoder, der beskrives i øjeblikket giver indblik i adfærdsmæssige og biokemiske undersøgelser til at belyse de funktionelle resultater af en kynurenine udvidelse. Disse protokoller vise en relation mellem KP, kognition og søvn, en tidligere uudforsket dynamik. Udnytte de detaljerede eksperimentelle metoder her vil styrke den videnskabelige forståelse af de funktionelle virkninger af kynurenine og KYNA neurobiologi i dyr. I sidste ende, fortsatte arbejde på dette område kan føre til nye terapeutiske tilgange til at afhjælpe resultater i enkeltpersoner bekæmpelse af psykiatriske forstyrrelser og afbrydelser i søvn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Den foreliggende undersøgelse blev delvis finansieret af National Institutes of Health (R01 NS102209) og en donation fra Clare E. Forbes Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wistar rats | Charles River Laboratories | adult male, 250-350 g | |
| L-kynurenine sulfate | Sai Advantium | ||
| ReproSil-Pur C18 column (4 mm x 150 mm) | Dr. Maisch GmbH | ||
| EZ Clips | Stoelting Co. | 59022 | |
| Mounting materials screws | PlasticsOne | 00-96 X 1/16 | |
| Nonabsorbable Sutures | MedRep Express | 699B | CP Medical Monomid Black Nylon Sutures, 4-0, P-3, 18", BOX of 12 |
| Absorbable Sutures | Ethicon | J310H | 4-0 Coated Vicryl Violet 1X27'' SH-1 |
| Dental Cement | Stoelting Co. | 51458 | |
| Drill Bit | Stoelting Co. | 514551 | 0.45 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alliance HPLC system | |||
| E2695 separation module | Waters | 176269503 | |
| 2475 fluorescence detector | Waters | 186247500 | |
| post-column reagent manager | Waters | 725000556 | |
| Lenovo computer | Waters | 668000249 | |
| Empower software | Waters | 176706100 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Passive avoidance box for rat | |||
| Extra tall MDF sound attenuating cubicle | MedAssociates | ENV-018MD | Interior: 22" (W) x 22" (H) x 16" (D) |
| Center channel modulator shuttle box chamber | MedAssociates | ENV-010MC | |
| Stainless steel grid floor for rat | MedAssociates | ENV-010MB-GF | |
| Auto guillotine door | MedAssociates | ENV-010B-S | |
| Quick disconnect shuttle grid floor harness for rat | MedAssociates | ENV-010MB-QD | |
| Stimulus light, 1" white lens, mounted on modular panel | MedAssociates | ENV-221M | |
| Sonalert module with volume control for rat chamber | MedAssociates | ENV-223AM | |
| SmartCtrl 8 input/16 output package | MedAssociates | DIG-716P2 | |
| 8 Channel IR control for shuttle boxes | MedAssociates | ENV-253C | |
| Infrared source and dectector array strips | MedAssociates | ENV-256 | |
| Tabletop interface cabinet, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080C | |
| Dual range constant current aversive stimulation module | MedAssociates | ENV-410B | |
| Solid state grid floor scrambler module | MedAssociates | ENV-412 | |
| Dual A/B shock control module | MedAssociates | ENV-415 | |
| 2' 3-Pin mini-molex extension | MedAssociates | SG-216A-2 | |
| 10' Shock output cable, DB-9 M/F | MedAssociates | SG-219G-10 | |
| Shuttle shock control cable 15', 6 | MedAssociates | SG-219SA | |
| Small tabletop cabinet and power supply, 120 V 60 Hz | MedAssociates | SG-6080D | |
| PCI interface package | MedAssociates | DIG-700P2-R2 | |
| Shuttle box avoidance utility package | MedAssociates | SOF-700RA-7 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sleep-Wake Monitoring Equipment | |||
| Ponehmah software | Data Sciences International (DSI) | PNP-P3P-610 | |
| MX2 8 Source Acquisition interface | Data Sciences International (DSI) | PNM-P3P-MX204 | |
| Dell computer, Optiplex 7020, Windows 7, 64 bit | Data Sciences International (DSI) | 271-0112-013 | |
| Dell 19" computer monitor | Data Sciences International (DSI) | 271-0113-001 | |
| Receivers for plastic cages, 8x | Data Sciences International (DSI) | 272-6001-001 | |
| Cisco RV130 VPN router | Data Sciences International (DSI) | RV130 | |
| Matrix 2.0 | Data Sciences International (DSI) | 271-0119-001 | |
| Network switch | Data Sciences International (DSI) | SG200-08P | |
| Neuroscore software | Data Sciences International (DSI) | 271-0171-CFG | |
| Two biopotential channels transmitter, model TL11M2-F40-EET | Data Sciences International (DSI) | 270-0134-001 |
References
- Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
- Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia - From Molecules to Behavior. Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. , Elsevier, Academic Press. London, San Diego, Waltham, Oxford. 423-443 (2016).
- Hilmas, C., et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications. Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).
- Perkins, M. N., Stone, T. W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).
- DiNatale, B. C., et al. Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling. Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).
- Wang, J., et al. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).
- Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine. Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).
- Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning. Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).
- Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits. Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).
- Pocivavsek, A., et al. Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory. Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).
- Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats. Sleep. 40 (11), (2017).
- Halassa, M. M., et al. Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss. Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).
- Erhardt, S., et al. Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).
- Linderholm, K. R., et al. Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).
- Sathyasaikumar, K. V., et al. Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).
- Schwarcz, R., et al. Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).
- Pocivavsek, A., Rowland, L. M. Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).
- Shibata, K. Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).
- Buzsaki, G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).
- Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning. Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).
- Yamashita, M., Yamamoto, T. Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition. Brain Research. 1675, 116-126 (2017).
