एसए-जेड-गैलैक्टोसिडेस-आधारित स्क्रीनिंग सेनोथैरेपी ड्रग्स की पहचान के लिए परख
Summary
सेलुलर जीर्णता पुरानी उम्र से संबंधित रोगों के विकास में महत्वपूर्ण कारक है। चिकित्सीय की पहचान है कि लक्षित जीर्ण कोशिकाओं स्वस्थ उम्र बढ़ने का विस्तार करने के लिए वादा दिखाते हैं. यहाँ, हम एक कोशिकाओं में सेनेसी संबद्ध – Galactosidase गतिविधि की माप के आधार पर senothethetics की पहचान के लिए स्क्रीन करने के लिए एक उपन्यास परख प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
कोशिका जीर्णता एक स्वस्थ जीवन को नकारात्मक रूप से प्रभावित करने के लिए जाना जाता उम्र बढ़ने की पहचान में से एक है. सेल संस्कृति में विशेष रूप से सेनेसेंट कोशिकाओं को मारने में सक्षम दवाएं, जिसे सेनोलिटिक्स कहा जाता है, विवो में जीर्ण सेल बोझ को कम कर सकती है और स्वास्थ्य विस्तार कर सकती है। Senolytics के कई वर्गों HSP90 inhibitors सहित तारीख करने के लिए पहचान की गई है, Bcl-2 परिवार inhibitors, piperlongumine, एक FOXO4 निरोधात्मक पेप्टाइड और Dasatinib के संयोजन / बढ़ी हुई लाइसोसोमल पीएच पर एसए-जेड-गल का पता लगाना जीर्ण कोशिकाओं का पता लगाने के लिए सबसे अच्छा विशेषता मार्करों में से एक है। एक डीएनए intercalating Hoechst डाई का उपयोग कर कुल सेल संख्या के निर्धारण के साथ संयोजन में फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट सी12FDG का उपयोग कर senescence-associated -galactosidase (एसए-जेड-गल) गतिविधि के लाइव सेल माप एक डीएनए intercalating Hoechst डाई का उपयोग कर की संभावना को खोलता है सेनोथैरेपी दवाओं के लिए स्क्रीन जो या तो सेनेसेंट कोशिकाओं (सेनोलिटिक्स) की हत्या करके या एसए-जेड-गल और अन्य फीनोटाइप्स को दबाकर समग्र एसए-जेड-गल गतिविधि को कम करती है। एक उच्च सामग्री फ्लोरोसेंट छवि अधिग्रहण और विश्लेषण मंच का उपयोग एसए-जेड-गल, सेल आकारिकी और सेल नंबर पर प्रभाव के लिए दवा पुस्तकालयों के तेजी से, उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है।
Introduction
सेलुलर जीर्णता Leonard Hayflick और पॉल Moorhead, जो पता चला है कि सामान्य कोशिकाओं को संस्कृति1में proliferate करने के लिए एक सीमित क्षमता थी द्वारा पहली बार के लिए वर्णित किया गया था. पोषक तत्वों, वृद्धि कारकों और संपर्क अवरोध की कमी के बावजूद सेसेंट कोशिकाएंबढ़ने में विफल रहती हैं, लेकिन चयापचयी रूप से सक्रिय रहती हैं। इस घटना प्रतिकृति sensence के रूप में जाना जाता है और मुख्य रूप से telomere छोटा करने के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था, कम से कम मानव कोशिकाओं में3. आगे के अध्ययनों से पता चला है कि कोशिकाओं को भी अन्य उत्तेजनाओं के जवाब में जीर्णता से गुजरना करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है, इस तरह के oncogenic तनाव के रूप में (oncogene प्रेरित जीर्णता, OIS), डीएनए क्षति, साइटोटॉक्सिक दवाओं, या विकिरण (तनाव प्रेरित जीर्णता, एसआईएस)4 , 5 , 6. डीएनए क्षति के जवाब में, टेलोमेयर क्षरण सहित, कोशिकाएं या तो सेनेसिस, अनियंत्रित कोशिका वृद्धि शुरू करें, या यदि क्षति की मरम्मत नहीं की जा सकती तो एपोप्टोसिस से गुजरना। इस मामले में, कोशिका जीर्णता फायदेमंद लगती है क्योंकि यह ट्यूमर दमनकारी तरीके से कार्य करतीहै 2। इसके विपरीत, डीएनए क्षति सहित सेलुलर क्षति के संचय के कारण उम्र बढ़ने के साथ जीर्णता बढ़ जाती है। चूंकि जीर्ण कोशिकाओं साइटोकिन्स, मेटलोप्रोटीनेस और विकास कारकों को स्रावित कर सकती है, जिसे जीर्णता-संबद्ध स्रावी फीनोटाइप (एसएएसपी) कहा जाता है, सेलुलर सेनेसी और एसएएसपी में यह आयु-निर्भर वृद्धि ऊतक होमोस्टेसिस में योगदान देती है और बाद में उम्र बढ़ने. इसके अलावा, जीर्णता बोझ में इस उम्र पर निर्भर वृद्धि चयापचय रोगों, तनाव संवेदनशीलता,progeria सिंड्रोम, और बिगड़ा चिकित्सा 7,8 प्रेरित करने के लिए जाना जाता है और भाग में, कई उम्र से संबंधित के लिए जिम्मेदार है रोग, जैसे एथेरोस्क्लेरोसिस, ऑस्टियोआर्थराइटिस, मांसपेशियों के अध: पतन, अल्सर गठन, और अल्जाइमर रोग9,10,11,12,13. जीर्ण कोशिकाओं को समाप्त करने से ऊतक रोग को रोकने या उसमें विलंब करने में मदद मिल सकती है और स्वास्थ्य विस्तार14. यह ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में दिखाया गया है14,15,16 के रूप में अच्छी तरह के रूप में senolytic दवाओं और दवा संयोजन है कि दोनों दवा स्क्रीनिंग प्रयासों और bioinformatic विश्लेषण के माध्यम से की खोज की थी का उपयोग करके विशेष रूप से जीर्ण कोशिकाओं में विशेष रूप से प्रेरित पथ17,18,19,20,21,22. अधिक इष्टतम senothethetic दवाओं की पहचान, और अधिक प्रभावी ढंग से senescent सेल बोझ को कम करने में सक्षम, स्वस्थ उम्र बढ़ने के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण के विकास में एक महत्वपूर्ण अगला कदम है.
सेन्सेन्ट कोशिकाएं संस्कृति और विवो दोनों में विशिष्ट लक्षणीय और आण्विक विशेषताएं दर्शाती हैं। ये जीर्णता मार्कर या तो कारण या जीर्णता प्रेरण या इन कोशिकाओं में आणविक परिवर्तन का प्रतिफल का परिणाम हो सकता है. तथापि, विशेष रूप से जीर्ण कोशिकाओं में कोई एकल मार्कर नहीं पाया जाता है। वर्तमान में, जीर्णता-संबद्ध -galactosidase (एसए-जेड-गल) का पता लगाने के सबसे अच्छा विशेषता और स्थापित एकल सेल आधारित तरीकों में से एक है इन विट्रो में और विवो में जीर्णता को मापने के लिए. एसए-जेड-गल पीएच 4 में एक इष्टतम एंजाइमी गतिविधि के साथ एक लाइसोमल हाइड्रोलेस है। पीएच 6 पर इसकी गतिविधि को मापना संभव है क्योंकि जीर्ण कोशिकाएं लाइसोसोमल गतिविधि23,24में वृद्धि दर्शाती हैं . जीवित कोशिकाओं के लिए, बढ़ी हुई लाइसोसोमल पीएच धानी एच+-ATPase अवरोध करनेवाला Bafilomycin A1 या एंडोसोमल अम्लअवरोधक्लोक्विन25,26के साथ lysomal क्षारीकरण द्वारा प्राप्त की है। 5-Dodecanoylaminofluorescein Di-जेड-डी-गैलैक्टोपाइरानोसाइड (सी12FDG) जीवित कोशिकाओं में सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह अपने 12 कार्बन lipophilic moiety25के कारण कोशिकाओं में cleaved उत्पाद बरकरार रखता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि एसए-जेड-गल गतिविधि स्वयं जीर्ण कोशिकाओं में पहचाने गए किसी भी मार्ग से सीधे तौर पर जुड़ा हुआ नहीं है और यह जीर्णता को प्रेरित करने के लिए आवश्यक नहीं है। इस परख के साथ, जीर्ण कोशिकाओं विषम कोशिका आबादी और उम्र बढ़ने के ऊतकों में भी पहचाना जा सकता है, ऐसे बड़े व्यक्तियों से त्वचा बायोप्सी के रूप में. इसका उपयोग कोशिका जीर्णता और आयु 23 के बीच सहसंबंध को दिखाने के लिए भी किया गया है क्योंकि यह कई जीवों और स्थितियों में जीर्ण कोशिका का पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय मार्करहै 27,28,29, 30| यहाँ, एक उच्च थ्रूपुट एसए-जेड-गल स्क्रीनिंग परख फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट सी12FDG पर आधारित प्राथमिक माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ) का उपयोग कर मजबूत ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरित सेल सेनेसी का वर्णन किया गया है और इसके फायदे और नुकसान चर्चा कर रहे हैं. हालांकि इस परख विभिन्न प्रकार के सेल के साथ किया जा सकता है, Ercc1की कमी का उपयोग, डीएनए की मरम्मत बिगड़ा MEFs ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति में जीर्णता के और अधिक तेजी से प्रेरण के लिए अनुमति देता है. चूहों में, डीएनए की मरम्मत endonuclease ERCC1-XPF की कम अभिव्यक्ति बिगड़ा डीएनए की मरम्मत का कारण बनता है, अंतर्जात डीएनए क्षति के त्वरित संचय, ऊंचा ROS, mitochondrial रोग, वृद्धि हुई जीर्ण सेल बोझ, स्टेम सेल समारोह की हानि और समय से पहले उम्र बढ़ने , प्राकृतिक उम्र के समान31,32. इसी प्रकार, Ercc1कमी MEFs संस्कृति17में और अधिक तेजी से जीर्णता से गुजरना . जीर्ण एमईएफ परख की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि प्रत्येक अच्छी तरह से जीर्ण और गैर संवेदनशील कोशिकाओं का एक मिश्रण है, जीर्ण सेल विशेष प्रभाव का स्पष्ट प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है. हालांकि, हालांकि हम मानते हैं कि प्राथमिक कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव का उपयोग सेनेसेंटेंस प्रेरित करने के लिए अधिक शारीरिक है, इस परख भी सेल लाइनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है जहां संवेदनशीलता एटोपोसाइड या विकिरण जैसे डीएनए हानिकारक एजेंटों के साथ प्रेरित किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एसए-जेड-गल मूल रूप से Dimri एट अल द्वारा की खोज की सेलुलर senscence के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित biomarker है. (1995) यह दर्शाता है कि जीर्ण मानव फाइब्रोब्लास्ट्स ने एसए-जेड-गल की गतिविधि में वृद्धि की है जब पीएच 6<sup class="xref…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH अनुदान AG043376 (परियोजना 2 और कोर ए, पीडीआर द्वारा समर्थित किया गया था; परियोजना 1 और कोर बी, LJN) और AG056278 (परियोजना 3 और कोर ए, पीडीआर; और परियोजना 2, LJN) और ग्लेन फाउंडेशन (LJN) से एक अनुदान.
Materials
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
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