La senescenza cellulare è il fattore chiave nello sviluppo di patologie croniche legate all'età. L'identificazione delle terapie che colpisce le cellule senescenti è promettente per estendere l'invecchiamento sano. Qui, presentiamo un nuovo saggio da vagliare per l'identificazione delle senoterapie sulla base della misurazione dell'attività di senescenza associata a z-Galactosidase in singole cellule.
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Articolo metodologico
Saggio di screening basato su SA-Galactosidase per l'identificazione dei farmaci senoterapici
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La senescenza cellulare è uno dei segni distintivi dell'invecchiamento noto per influenzare negativamente una vita sana. I farmaci in grado di uccidere le cellule senescenti specificamente nella coltura cellulare, chiamato senolitico, possono ridurre il carico di cellule senescenti in vivo ed estendere la salute. Diverse classi di senolitica sono state identificate fino ad oggi, tra cui inibitori HSP90, inibitori della famiglia Bcl-2, piperlongumine, un peptide inibitorio FOXO4 e la combinazione di Dasatinib/Quercetin. La rilevazione di SA-z-Gal in un pH lisonico aumentato è uno dei migliori marcatori caratterizzati per la rilevazione di cellule senescenti. Le misurazioni delle cellule vive dell'attività di senescenza associati alla galactosidasi (SA-z-Gal) utilizzando il substrato fluorescente C12FDG in combinazione con la determinazione del numero totale di cellule utilizzando un colorante Hoechst intercalante del DNA apre la possibilità di schermo per i farmaci senoteri che riducono l'attività complessiva di SA-z-Gal uccidendo cellule senescenti (senolytica) o sopprimendo SA-z-Gal e altri fenotipi delle cellule senescenti (senomorfici). L'uso di una piattaforma di acquisizione e analisi di immagini fluorescenti ad alto contenuto consente di uno screening rapido e ad alto consumo delle librerie di farmaci per gli effetti sulla SA-z-Gal, la morfologia cellulare e il numero di cellule.
Introduzione
La senescenza cellulare è stata descritta per la prima volta da Leonard Hayflick e Paul Moorhead, che hanno dimostrato che le cellule normali avevano una capacità limitata di proliferare nella coltura1. Le cellule senescenti non riescono a proliferare nonostante la presenza di nutrienti, fattori di crescita e mancanza di inibizione del contatto, ma rimangono metabolicamente attivi2. Questo fenomeno è noto come senescenza replicativa ed è stato attribuito principalmente all'accorciamento dei telomeri, almeno nelle cellule umane3. Ulteriori studi hanno dimostrato che le cellule possono anche essere ....
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Protocollo
L'uso degli animali è stato approvato dallo Scripps Florida Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Generazione di fibroblasto embrionale murino senescente (MEF) – 12-15 giorni
- Isolare il tipo selvaggio e Ercc1-/- MEF da topi femmine in gravidanza alla giornata embrionale 13 (E13) come descritto in precedenza33.
NOTA: Tutti i seguenti passaggi vengono eseguiti in una cappa di coltura tissutale in condizioni asettiche e utilizzando strumenti sterili. - Rivedere la testa dell'embrione sopra gli occhi.
- Rimuovere il tessuto rosso (cuore e fegato) e utilizzarli pe....
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Risultati
L'attività di SA-z-Gal può essere rilevata in cellule che sono indotte a senescenza da vari modi da esaurimento replicativo, stress genotossico e ossidativo, all'attivazione dell'oncogene23,25,38. Nell'attuale modello che utilizza le cellule fibroblaste embrionali di Ercc1- carenti, le condizioni di crescita normossiche (20% O2) erano sufficienti a indurre la senescenza cellul.......
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Discussione
È un biomarcatore ben definito per la senescenza cellulare originariamente scoperto da Dimri et al. (1995) dimostrando che i fibroblasti umani senescenti hanno aumentato l'attività di SA-z-Gal se sono stati analisi al pH 623 rispetto alle cellule che proliferano. Nel frattempo, in vitro e in vivo sono stati stabiliti saggi per SA-z-Gal per diversi tipi di cellule e tessuti25,39,40. Il metodo a ce.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH Grants AG043376 (Progetto 2 e Core A, PDR; Progetto 1 e Core B, LJN) e AG056278 (Progetto 3 e Core A, PDR; e Project 2, LJN) e una sovvenzione della Glenn Foundation (LJN).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medio |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | |
| siero fetale | di bovino Tissue Culture Biologics | 101 | siero |
| 1x aminoacidi non essenziali | Corning | 25-025-Cl | aminoacidi |
| bafilomicina A1 | Sigma | B1793 | inibitore lisosomiale |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | substrato b-Gal |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | Agente di intercalazione del DNA |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | Inibitore HSP90 |
| Sistema di imaging cellulare InCell6000 | imaging ad alto contenuto | GE Healthcare |
Riferimenti
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology....
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Ristampe e permessi
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