SA-β-Galaktosidasbaserad screening analys för identifiering av Senoterapeutiska läkemedel
Summary
Cellulära åldras är den viktigaste faktorn i utvecklingen av kroniska åldersrelaterade sjukdomar. Identifiering av Therapeutics som riktar sig till senescent celler visar löfte om att förlänga hälsosamt åldrande. Här presenterar vi en ny analys till Screen för identifiering av senotherapeutics baserat på mätning av åldras associerade β-galaktosidas aktivitet i enskilda celler.
Abstract
Cell åldras är en av kännetecknen för åldrande kända för att negativt påverka en hälsosam livslängd. Droger som kan döda senescent celler specifikt i cellkultur, kallas senolytika, kan minska senescent cell börda in vivo och förlänga healthspan. Flera klasser av senolytika har identifierats hittills inklusive HSP90 hämmare, BCL-2 familj hämmare, piperlongumine, en FOXO4 hämmande peptid och kombinationen av dasatinib/quercetin. Detektion av SA-β-gal vid en ökad lysosomalt pH är en av de bäst karakteriserade markörer för detektion av senescent celler. Levande cell mätningar av senescens-associerad β-galaktosidas (sa-β-gal) aktivitet med det fluorescerande substratet C12FDG i kombination med bestämning av det totala cellnumret med hjälp av en DNA-interkalerande Hoechst Dye öppnar möjligheten att Screen för senoterapeutiska läkemedel som antingen minskar Total SA-β-gal aktivitet genom att döda senoida celler (senolytika) eller genom att undertrycka SA-β-gal och andra fenotyper av senescerande celler (senomorphics). Användning av en hög halt fluorescerande bild förvärv och analysplattform möjliggör snabb, hög genomströmning screening av läkemedelsbibliotek för effekter på SA-β-gal, cellmorfologi och cell nummer.
Introduction
Cellular åldras beskrevs för första gången av Leonard Hayflick och Paul Moorhead, som visade att normala celler hade en begränsad förmåga att förgöra sig i kultur1. Senescent celler misslyckas med att förgöra trots närvaron av näringsämnen, tillväxtfaktorer och brist på kontakthämning, men förblir metaboliskt aktiva2. Detta fenomen kallas replikativ åldras och var främst tillskrivs telomerförkortning, åtminstone i mänskliga celler3. Ytterligare studier har visat att celler också kan induceras att genomgå åldras som svar på andra stimuli, såsom onkogen stress (Onkogene inducerad åldras, OIS), DNA-skador, cytotoxiska läkemedel, eller bestrålning (Stress inducerad åldras, SIS)4 , ,5 , 6. som svar på DNA-skador, inklusive telomererosion, celler antingen senesce, starta okontrollerad celltillväxt, eller genomgå apoptos om skadan inte kan repareras. I detta fall verkar cell åldras vara fördelaktigt eftersom det agerar i en tumör suppressiv sätt2. I motsats, åldras ökas med åldrande på grund av ansamling av cellulära skador inklusive DNA-skador. Eftersom senescent celler kan utsöndra cytokiner, metalloproteinaser och tillväxtfaktorer, kallas åldras-associerade sekretoriska fenotyp (SASP), denna åldersberoende ökning av cellulära åldras och SASP bidrar till minskad vävnad homeostas och därefter åldras. Också, denna åldersberoende ökning av åldras bördan är känd för att inducera metabola sjukdomar, stress känslighet, progeri syndrom, och nedsatt läkning7,8 och är, delvis, ansvarig för de många åldersrelaterade sjukdomar, såsom åderförkalkning, artros, muskulös degeneration, magsår bildning, och Alzheimers sjukdom9,10,11,12,13. Eliminera senescent celler kan bidra till att förebygga eller fördröja vävnad dysfunktion och förlänga healthspan14. Detta har visats i transgena musmodeller14,15,16 samt genom att använda senolytiska läkemedel och kombinationer av läkemedel som upptäcktes genom både läkemedels screening insatser och bioinformatisk analys av vägar inducerade specifikt i senescent celler17,18,19,20,21,22. Identifiera mer optimala senoterapeutiska läkemedel, kunna mer effektivt minska senescent cell börda, är ett viktigt nästa steg i utvecklingen av terapeutiska metoder för hälsosamt åldrande.
Senescent celler uppvisar karakteristiska fenotypiska och molekylära egenskaper, både i kultur och in vivo. Dessa åldras markörer kan vara antingen orsaken eller resultatet av åldras induktion eller en biprodukt av molekylära förändringar i dessa celler. Emellertid, ingen enskild markör finns specifikt i senescent celler. För närvarande, åldras-associerade β-galaktosidas (sa-β-gal) upptäckt är en av de bäst kännetecknas och etablerade encelliga metoder för att mäta åldras in vitro-och in vivo. SA-β-gal är en lysosomala hydrolas med en optimal enzymatisk aktivitet vid pH 4. Att mäta sin aktivitet vid pH 6 är möjligt eftersom senescent celler visar ökad lysosomala aktivitet23,24. För levande celler, ökad lysosomalt pH erhålls genom lysosomala alkalinisering med vakuolär H+-ATPas hämmare bafilomycin a1 eller endosomala försurnings hämmare klorokin25,26. 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) används som substrat i levande celler eftersom den behåller den kluvna produkten i cellerna på grund av dess 12 kol lipofila delen25. Viktigt, SA-β-gal aktivitet i sig är inte direkt samband med någon väg som identifierats i senescent celler och är inte nödvändigt att inducera senescence. Med denna analys, senescent celler kan identifieras även i de heterogena cellpopulationer och åldrande vävnader, såsom hudbiopsier från äldre individer. Det har också använts för att visa ett samband mellan cell åldras och åldrande23 eftersom det är en pålitlig markör för senescent cell detektering i flera organismer och villkor27,28,29, 30. Här, en hög genomströmning sa-β-gal screeninganalys baserad på fluorescerande substrat C12FDG använder primära mus embryonala fibroblaster (MEFS) med robust oxidativ stress inducerad cell åldras beskrivs och dess fördelar och nackdelar diskuteras. Även om denna analys kan utföras med olika celltyper, användning av Ercc1-brist, DNA Repair nedsatt MEFS möjliggör snabbare induktion av åldras under förhållanden av oxidativ stress. Hos möss, minskat uttryck av DNA reparation Endonuklease ERCC1-XPF orsakar nedsatt DNA-reparation, accelererad ackumulering av endogena DNA-skador, förhöjda ROS, mitokondriell dysfunktion, ökad senescent cell börda, förlust av stamcells funktion och för tidigt åldrande, liknande naturligt åldrande31,32. På liknande sätt genomgår Ercc1-brist MEFS åldras snabbare i kultur17. Ett viktigt inslag i den senescent MEF analysen är att varje brunn har en blandning av senescent och icke-senescent celler, vilket möjliggör en tydlig demonstration av senescent cellspecifika effekter. Men, även om vi tror att användningen av oxidativ stress i primära celler för att inducera åldras är mer fysiologisk, denna analys kan också användas med cellinjer där åldras induceras med DNA-skadliga agenter som etoposid eller bestrålning.
Protocol
Representative Results
Discussion
SA-β-gal är en väldefinierad biomarkör för cellulär åldras som ursprungligen upptäcktes av dimri et al. (1995) visar att senescent humana fibroblaster har ökad aktivitet av SA-β-gal när analyseras vid pH 623 jämfört med prolifererande celler. Under tiden, in vitro-och in vivo-analys för sa-β-gal har fastställts för olika celltyper och vävnader25,39,40. Fluorescensbaserade encell…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH Grants AG043376 (projekt 2 och Core A, PDR; Projekt 1 och Core B, LJN) och AG056278 (projekt 3 och Core A, PDR; och projekt 2, LJN) och ett bidrag från Glenn Foundation (LJN).
Materials
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium |
| Ham's F10 | Gibco | 12390-035 | medium |
| fetal bovine serum | Tissue Culture Biologics | 101 | serum |
| 1x non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | amino-acids |
| bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | lysosomal inhibitor |
| C12FDG | Setareh Biotech | 7188 | b-Gal substrate |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | DNA intercalation agent |
| 17DMAG | Selleck Chemical LLC | 50843 | HSP90 inhibitor |
| InCell6000 Cell Imaging System | GE Healthcare | High Content Imaging System |
Riferimenti
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., di Fagagna, F. D. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).
- Zhu, J., Woods, D., McMahon, M., Bishop, J. M. Senescence of human fibroblasts induced by oncogenic Raf. Genes and Development. 12 (19), 2997-3007 (1998).
- Dimri, G. P., Itahana, K., Acosta, M., Campisi, J. Regulation of a senescence checkpoint response by the E2F1 transcription factor and p14(ARF) tumor suppressor. Molecular and Cellular Biology. 20 (1), 273-285 (2000).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Niedernhofer, L. J. Tissue-specific accelerated aging in nucleotide excision repair deficiency. Mechanisms of Ageing and Development. 129 (78), 408-415 (2008).
- Gitenay, D., et al. Glucose metabolism and hexosamine pathway regulate oncogene-induced senescence. Cell Death & Disease. 5, e1089 (2014).
- Erusalimsky, J. D., Kurz, D. J. Cellular senescence in vivo: its relevance in ageing and cardiovascular disease. Experimental Gerontology. 40 (8-9), 634-642 (2005).
- Kassem, M., Marie, P. J. Senescence-associated intrinsic mechanisms of osteoblast dysfunctions. Aging Cell. 10 (2), 191-197 (2011).
- Campisi, J., Andersen, J. K., Kapahi, P., Melov, S. Cellular senescence: A link between cancer and age-related degenerative disease. Seminars in Cancer Biology. 21 (6), 354-359 (2011).
- Golde, T. E., Miller, V. M. Proteinopathy-induced neuronal senescence: a hypothesis for brain failure in Alzheimer’s and other neurodegenerative diseases. Alzheimers Research & Therapy. 1 (2), 5 (2009).
- Telgenhoff, D., Shroot, B. Cellular senescence mechanisms in chronic wound healing. Cell Death & Differentiation. 12 (7), 695-698 (2005).
- Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
- Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. , (2016).
- Childs, B. G., et al. Senescent intimal foam cells are deleterious at all stages of atherosclerosis. Science. 354 (6311), 472-477 (2016).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Zhu, Y., et al. New agents that target senescent cells: the flavone, fisetin, and the BCL-XL inhibitors, A1331852 and A1155463. Aging. 9 (3), 955-963 (2017).
- Zhu, Y., et al. Identification of a Novel Senolytic Agent, Navitoclax, Targeting the Bcl-2 Family of Anti-Apoptotic Factors. Aging Cell. , (2015).
- Zhu, Y., et al. The Achilles’ heel of senescent cells: from transcriptome to senolytic drugs. Aging Cell. , (2015).
- Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
- Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature. , (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92 (20), 9363-9367 (1995).
- Itahana, K., Campisi, J., Dimri, G. P. Methods to detect biomarkers of cellular senescence: the senescence-associated beta-galactosidase assay. Methods in Molecular Biology. 371, 21-31 (2007).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-[beta]gal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. Journal of Visualized Experiments. 78 (78), (2013).
- Collado, M., et al. Tumour biology: Senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642 (2005).
- Krishnamurthy, J., et al. Ink4a/Arf expression is a biomarker of aging. The Journal of Clinical Investigation. 114 (9), 1299-1307 (2004).
- Mishima, K., et al. Senescence-associated beta-galactosidase histochemistry for the primate eye. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 40 (7), 1590-1593 (1999).
- Melk, A., et al. Expression of p16INK4a and other cell cycle regulator and senescence associated genes in aging human kidney. Kidney International. 65 (2), 510-520 (2004).
- Niedernhofer, L. J., et al. A new progeroid syndrome reveals that genotoxic stress suppresses the somatotroph axis. Nature. 444 (7122), 1038-1043 (2006).
- Wang, J., Clauson, C. L., Robbins, P. D., Niedernhofer, L. J., Wang, Y. The oxidative DNA lesions 8,5′-cyclopurines accumulate with aging in a tissue-specific manner. Aging Cell. 11 (4), 714-716 (2012).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (64), (2012).
- Jagannathan, L., Cuddapah, S., Costa, M. Oxidative stress under ambient and physiological oxygen tension in tissue culture. Current Pharmacology Reports. 2 (2), 64-72 (2016).
- Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. J Assist Reprod Genet. 31 (10), 1259-1267 (2014).
- Robinson, A. R., et al. Spontaneous DNA damage to the nuclear genome promotes senescence, redox imbalance and aging. Redox Biology. 17, 259-273 (2018).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal Of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Biomarkers of cell senescence assessed by imaging cytometry. Methods in Molecular Biology. 965, 83-92 (2013).
- Yang, N. -. C., Hu, M. -. L. A fluorimetric method using fluorescein di-β-d-galactopyranoside for quantifying the senescence-associated β-galactosidase activity in human foreskin fibroblast Hs68 cells. Analytical Biochemistry. 325 (2), 337-343 (2004).
- Zhao, J., et al. Quantitative Analysis of Cellular Senescence in Culture and In Vivo. Current Protocols in Cytometry. 79, (2017).
- Capparelli, C., et al. CDK inhibitors (p16/p19/p21) induce senescence and autophagy in cancer-associated fibroblasts, "fueling" tumor growth via paracrine interactions, without an increase in neo-angiogenesis. Cell Cycle. 11 (19), 3599-3610 (2012).
- Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Pathology. 5, 99-118 (2010).
- Mah, L. J., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. GammaH2AX as a molecular marker of aging and disease. Epigenetics. 5 (2), 129-136 (2010).
- Hewitt, G., et al. Telomeres are favoured targets of a persistent DNA damage response in ageing and stress-induced senescence. Nature Communications. 3, 708 (2012).
- Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
- Georgakopoulou, E. A., et al. Specific lipofuscin staining as a novel biomarker to detect replicative and stress-induced senescence. A method applicable in cryo-preserved and archival tissues. Aging-Us. 5 (1), 37-50 (2013).
- Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is β-Galactosidase Staining a Marker of Senescence in Vitro and in Vivo?. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
