تسجيلات إمكانات العمل البصرية الخاصة بالنوع الفرعي في الإنسان التي يسببها Pluripotent الخلايا الجذعية المشتقة من Cardiomyocytes البطين
Summary
هنا نقدم طريقة بصريا إمكانات العمل في الصورة، على وجه التحديد في cardiomyocytes البطين مثل المستحثة pluripotent المستمدة من الخلايا الجذعية. الأسلوب الذي يستند إلى التعبير يحركها المروج بروتين فلوري المراعية للجهد.
Abstract
كارديوميوسيتيس المتولدة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (اللجنة التوجيهية-سم) أداة ناشئة في أبحاث القلب والأوعية الدموية. بدلاً من أن يكون عدد سكان متجانسة من الخلايا، تمثل اللجنة التوجيهية-CMs إنشاؤها بواسطة بروتوكولات المفاضلة الحالية خليط خلايا مع البطين-، أذينية-، وتعمل مثل العقدي، مما يزيد من تعقيد التحليلات المظهرية. ويرد هنا، طريقة لإمكانات العمل سجل بصريا على وجه التحديد من البطين مثل اللجنة التوجيهية-المهاجرة. ويتحقق ذلك بتوصيل لينتيفيرال مع بناء الذي مؤشر جهد المرمزة وراثيا تحت سيطرة عنصر المروج البطين على حدة. عندما يتم ترانسدوسيد اللجنة التوجيهية-المهاجرة مع هذا البناء، هو استشعار الجهد أعرب حصرا في البطين مثل الخلايا، تمكين غشاء البصرية الخاصة بالنوع الفرعي تسجيلات المحتملة باستخدام مجهر الأسفار الوقت الفاصل بين.
Introduction
Cardiomyocytes (CMs) المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) أداة ناشئة تشريح الآليات الجزيئية لأمراض القلب، للتحقيق في رواية العلاجات، وشاشة للآثار السلبية للمخدرات القلب1،2 ،3. منذ البداية، كانت الأمراض أرهيثموجينيك مثل تشانيلوباثيس أحد مجالات تركيز هامة لهذا المجال البحث4. ونتيجة لذلك، أساليب للتحقيق تعمل الكهربائية لنظام الإدارة الوظيفية، مثل عدم انتظام ضربات القلب أو التغييرات في الإجراءات المحتملة (AP) مورفولوجيس، في صميم هذه التكنولوجيا.
اعتبار هام في تطبيق اللجنة التوجيهية-المهاجرة إلا تؤدي الحالية التمايز القلب البروتوكولات في عدد سكان متجانسة من الخلايا. بدلاً من ذلك، أنهم بدلاً من خليط من الخلايا تشبه العقدة الجيب أذينية، والمهاجرة البطين على مستويات مختلفة من النضج5،6،،من78. عدم تجانس هذه يمكن أن تكون مصدر ذات صلة تجريبية تقلب، خاصة إذا كان يتم التحقيق معلمات مثل مدة AP (APD)، الذي جوهريا تختلف بين الأنواع الفرعية سم (مثلاً، APD أقصر في الرجفان مما في البطين اتفاقية الأنواع المهاجرة). النهج التقليدي لمعالجة هذه المشكلة هو التحقيق في اللجنة التوجيهية-CMs واحد باستخدام الأسلوب المشبك التصحيح وتصنيف كل خلية العقدي-، أذينية-، أو الشبيهة بالبطين، استناداً إلى مورفولوجيا أ فب9. يمكن تقييد أي تحليل اللاحقة ثم إلى الخلايا تمثل النوع الفرعي سم للفائدة. العيب الرئيسي لهذه الاستراتيجية هو الإنتاجية المحدودة وعدم قابلية التوسع. وعلاوة على ذلك، لا تسمح طبيعة الغازية التصحيح المشبك الكهربية تصوير الخلايا نفس التتابع على مدى فترات زمنية طويلة.
هنا، نحن نقدم تفاصيل التجريبية على أسلوب10 وضعت على بصريا صورة APs في أنواع فرعية محددة من اللجنة التوجيهية-المهاجرة. هذا يتغلب على مشكلة عدم تجانس النوع الفرعي ويزيد الإنتاجية مقارنة بالأساليب التقليدية، يسمح فينوتيبينج السريع للجنة التوجيهية-المهاجرة تحمل المتغيرات الجينية أو يجري وكلاء المكشوفة الدوائية بشكل كبير.
نظرة عامة على النهج التصوير الضوئية الخاصة بالنوع الفرعي
مؤشر جهد المرمزة وراثيا (جيفي)، تغيير خصائصه الأسفار عند depolarization و repolarization من غشاء الخلية، يستخدم للصور بصريا التغييرات من إمكانات غشاء الأنواع المهاجرة. جيفي المطبقة هنا هي البروتين الفلورسنت الاستشعار من الجهد فسفب-الجمهورية التشيكية11، الذي يتألف من مجال transmembrane الاستشعار عن الجهد تنصهر فيها زوج خضراء (البرسيم) وبروتين فلورسنت أحمر (mRuby2) (الشكل 1A). بسبب قرب fluorophores اثنين، نتائج إثارة البروتينات الفلورية الخضراء في جزء صغير من الطاقة الإثارة التي يجري نقلها إلى الأحمر نيون البروتين عن طريق نقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق). ولذلك، نتائج إثارة البروتينات الفلورية الخضراء في انبعاثات من الأخضر والأحمر البروتينات الفلورية (الشكل 1A، اللوحة العلوية). عند الخلية ديبولاريزيس، يحدث إعادة ترتيب هيكلية لاستشعار الجهد الذي يترجم إلى إعادة توجيه من البروتينات الفلورية اثنين، زيادة كفاءة الحنق. وهكذا، نقل أكثر من طاقة الإثارة من الأخضر للبروتين الأحمر نيون (الشكل 1A، لوحة أقل). نتيجة لذلك في خلية ديبولاريزيد، انبعاث فلورية خضراء باهتة، وأكثر إشراقا من انبعاث ومضان أحمر في زنزانة في استراحة غشاء المحتملة (الشكل 1B).
رقم 1: التصوير الضوئي من غشاء المحتملة مع فسفب-CR. (A) A تخطيطي يصور عمل البروتين الفلورسنت المراعية للجهد ويرد فسفب-الجمهورية التشيكية. عند ديبولاريزيشن لغشاء الخلية، إعادة ترتيب هيكلية في مجال الاستشعار عن بعد الجهد transmembrane يترجم إلى إعادة توجيه الأخضر (التجارة والنقل) والحمراء بروتين فلوري (RFP)، زيادة كفاءة فورستر إينتراموليكولار صدى نقل الطاقة (بكى). ويرد (ب) الانبعاثات الأطياف من فسفب على الإثارة التجارة والنقل في الخلايا في إمكانات غشاء يستريح (اللوحة العلوية) والخلايا ديبولاريزيد (أسفل اللوحة). التغيير الطيفية عند depolarization مبالغ فيها للوضوح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
التغييرات في كفاءة الحنق النسخ المتطابق بتقلبات الغشاء المحتملة هي تصويرها استخدام مجهر الأسفار مزودة صورة الفاصل، الذي يفصل بين انبعاثات ومضان أحمر وأخضر ومشاريع منها على المناطق المجاورة اثنين من الرقاقة من كاميرا سكموس (الشكل 2). مع هذا الإعداد، انبعاث fluorescence في شريطين مختلفة الطول الموجي يمكن تسجيلها في وقت واحد، مما يسمح حساب نسبة الأسفار الأحمر إلى الأخضر تعبر الغشاء المحتملة في كل صورة من سلسلة الوقت الفاصل بين.
رقم 2: تكوين نظام التصوير- المكونات الرئيسية لنظام التصوير المستخدمة للصورة يصور التغيرات الطيفية من البروتين الفلورسنت المراعية للجهد النسخ المتطابق غشاء التغييرات المحتملة في عالية دقة زمنية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
يتحقق التعبير عن فسفب-الجمهورية التشيكية في نظام الإدارة الوظيفية عن طريق توصيل لينتيفيرال. مباشرة التعبير إلى نوع فرعي سم من الفائدة، يحتوي لينتيفيروس على عنصر مروج (محسن MLC2v ) محركات النسخ على وجه التحديد في البطين مثل اللجنة التوجيهية-CMs10. عندما يتم ترانسدوسيد اللجنة التوجيهية-المهاجرة التي تمثل مزيجاً خلايا الشبيهة بالرجفان والعقدي مثل البطين مثل مع هذا lentivirus، يتم التعبير عن فسفب-CR فقط في الخلايا الشبيهة بالبطين. منذ التصوير الضوئية إمكانات العمل يعتمد على هذا الاستشعار الفلورسنت، تمثل إمكانات العمل المسجلة حصرا سم النوع الفرعي للفائدة (الشكل 3).
الشكل 3: التعبير فسفب يحركها المروج للتصوير المحتملة غشاء نوع فرعي على حدة. () هذا التخطيطي يوضح كيف تتحقق التسجيلات إمكانات العمل البصرية الخاصة بالنوع الفرعي كارديوميوسيتي. (ب) اللجنة التوجيهية-المهاجرة المصابة مع فسفب تحت سيطرة البطين الخاصة MLC2v-محسن ترد. ويلاحظ التعبير عن استشعار الجهد فقط في البطين مثل نظام الإدارة الوظيفية في قناة التجارة والنقل (اللوحة اليمنى). وترد أيضا مرحلة التباين (الفريق الأوسط) وتراكب الصورة (اللوحة اليمنى). خطوط منقطة أبيض علامة حدود الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Protocol
Representative Results
Discussion
تمكن الطريقة الموصوفة هنا على تسجيل بصري لوكالة الأنباء الجزائرية من نوع فرعي محدد (أي، البطين مثل الخلايا) من اتفاقية الأنواع المهاجرة التي ولدت من إيبسكس البشرية. اللجنة التوجيهية-المهاجرة البشرية أداة ناشئة للتصدي لمجموعة كبيرة من المشاكل الطبية والبيولوجية، والتمايز إلى أنواع ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل المنح المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية (Si 1747/1-1) وآخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ für Deutsche Stiftung هيرزفورشونج.
Materials
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS(Fetal Bovine Serum) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140050 | |
| GlutaMax-I Supplement | Invitrogen | 35050061 | alternative L-Glutamine |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Collagenase type II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | H9268 | enhancing lentiviral infection |
| 3.5 cm glass-bottom microdishes | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Microscope stand | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | DMI6000B | |
| Microscope objective | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | HCX PL APO 63x/1.4-0.6 Oil | |
| sCMOS camera | Andor Technology, Belfast, UK | Zyla V | |
| Microscope filter cube: excitation filter | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | bandpass 480/40 |
| Microscope filter cube: dichroic mirror | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | longpass 505 nm |
| Image splitter | Cairn Research, Faversham, UK | OptoSplit II | |
| Image splitter filter cube: dichroic mirror | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 1 (GFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 520/28 BrightLine HC | bandpass 520/28 nm |
| Image splitter filter cube: emission filter 2 (RFP emission) | AHF Analysentechnik GmbH, Tübigen, Germany | 630/75 ET Bandpass | bandpass 630/75 nm |
| Pacing inset | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS | |
Riferimenti
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
- Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research. Current Cardiology Reports. 19 (3), 23 (2017).
- Rocchetti, M., et al. Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).
- Sinnecker, D., et al. Modeling long-QT syndromes with iPS cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).
- Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art. Life Sciences. , 98-113 (2016).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Den Hartogh, S. C., Passier, R. Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity. Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).
- Schweizer, P. A., et al. Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229 (2017).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Chen, Z., et al. Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes. European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).
- Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scientific Reports. 7, 5464 (2017).
- Dorn, T., et al. Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity. Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).
- Kaestner, L., et al. Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).
