In Vitro Ricostituzione di Self-Organizing pattern proteico su lipidici supportati

Summary

Forniamo un protocollo per in vitro test di auto-organizzazione della mente e la mia su un doppio strato lipidico supportati in una camera aperta. Inoltre, descriviamo come racchiudere il dosaggio del lipido-clad PDMS microcompartments per simulare condizioni in vivo di confinamento di reazione.

Abstract

Molti aspetti dell'organizzazione spatiotemporal fondamentale delle cellule sono regolati dai sistemi del tipo di reazione-diffusione. In vitro la ricostituzione di tali sistemi permette per studi dettagliati dei loro meccanismi di fondo che non sarebbe fattibile in vivo. Qui, forniamo un protocollo per la ricostituzione in vitro del sistema MinCDE di Escherichia coli, che posiziona il setto di divisione delle cellule nel mezzo delle cellule. Il dosaggio è stato progettato per fornire solo i componenti necessari per l'auto-organizzazione, vale a dire una membrana, le due proteine mente e MinE ed energia sotto forma di ATP. Abbiamo pertanto fabbricare una camera di reazione aperta su un vetrino coprioggetti, su cui si forma un doppio strato lipidico supportati. Il design aperto della camera permette per la preparazione ottimale del bilayer del lipido e manipolazione controllata dei contenuti alla rinfusa. Le due proteine, mente e MinE, nonché ATP, vengono quindi aggiunti nel volume di massa sopra la membrana. La formazione immagine è possibile da molti microscopie ottiche, come i supporti di progettazione confocale, grandangolari e microscopia TIRF allo stesso modo. In una variante del protocollo, il doppio strato lipidico è formato su un supporto di fantasia, su microstrutture PDMS a forma di cellulare, invece di vetro. Abbassando la soluzione di massa fino all'orlo di questi comparti racchiude la reazione in un vano più piccolo e fornisce i confini che permettono che imita di in vivo comportamento oscillatorio. Presi insieme, descriviamo i protocolli per ricostituire il sistema MinCDE sia con che senza confinamento spaziale, consentendo ai ricercatori di controllare con precisione tutti gli aspetti che influenzano la formazione di pattern, ad esempio intervalli di concentrazione e l'aggiunta di altri fattori o proteine e sistematicamente aumentare la complessità del sistema in un relativamente semplice messa a punto sperimentale.

Introduction

Reticoli spatiotemporal sono essenziali nella natura, che regolano attività complesse a livello pluricellulare e cellulare, da morfogenesi a divisione cellulare regolamentati^1,2. Sistemi di reazione-diffusione svolgono un ruolo importante nella creazione di questi modelli, ma sono ancora non ben compreso. Un primo esempio di un sistema di reazione-diffusione e il miglior sistema biologico caratterizzato finora è l'Escherichia coli MinCDE sistema^3,4,5,6,7. Il sistema di MinCDE oscilla dal Polo di cella al Polo di cella in e. coli per determinare la metà della cella come il sito di futura Divisione. Questo sistema si basa sulla mente dell'atpasi, l'atpasi proteina d'attivazione, miniera e la membrana come una reazione spaziale matrice⁸. MinC non fa parte del meccanismo di formazione del modello, ma è l'effettivo agente funzionale: un inibitore della divisome principale proteina FtsZ^5,6. MinC si lega alla mente e quindi segue le oscillazioni, risultante in un gradiente di concentrazione di tempo-mediata della proteina che è massima ai poli della cellula e minima al centro delle cellule, consentendo solo FtsZ a polimerizzare a midcell^9,10 . Il sistema di MinCDE è parte della più grande famiglia di Walker A ATPases che sono fondamentali per l'organizzazione spazio-temporale in batteri², per il posizionamento e trasporto della proteina complessi¹¹ e plasmidi¹² e per la regolazione delle cellule Divisione¹³ e cromosoma segregazione¹⁴. Quindi, il sistema di reazione-diffusione di MinCDE non solo rappresenta un sistema di reazione-diffusione archetipico, ma ha anche attirato l'attenzione per la sua importanza per l'organizzazione spazio-temporale nei batteri.

Studi dettagliati funzionali del MinCDE sistema in vivo sono complicati, come manipolazione dell'omissione del gene e proteine in genere causare difetti di divisione cellulare. Inoltre, cambiando la composizione della membrana o le proprietà del citosol in vivo è molto impegnativo^15,16. Modifiche al sistema e fattori che sono difficili da interpretare nel complesso ambiente della cellula, ancor di più se è disturbato in una funzione così essenziale come la divisione cellulare. Noi ed altri abbiamo quindi girato per un approccio in vitro la ricostituzione, riducendo il sistema ai relativi componenti di base: mente, miniera, trifosfato di adenosina come fonte di energia e il doppio strato lipidico supportati come una reazione matrice^{6,17, 18}. questo approccio bottom-up permette di sondare il meccanismo di auto-organizzazione in dettaglio senza la complessità di una cellula vivente. La forma di proteine viaggiando superficie onde⁶ e altri tipi di modelli^17,19 in queste condizioni, anche se con una lunghezza d'onda che è di solito circa un ordine di grandezza maggiore di in vivo. L'uso di una camera aperta facilita un controllo preciso su tutti gli aspetti che influenzano la formazione di pattern: proteina concentrazioni⁶, proteina proprietà²⁰, membrana composizione¹⁰, buffer composizione e concentrazione di ATP ⁶, anche con aggiunta di altri fattori quali affollamento agenti²¹ e altre proteine di divisome²². In confronto, la ricostituzione in vitro del sistema MinCDE in una cella di flusso^18,19,23 può essere utilizzata per l'influenza del flusso^17,23, proteina della sonda limitando le condizioni¹⁹, membrana composizione¹⁹ e confinamento 3D¹⁸ il pattern proteico, ma esegue il rendering di un controllo esatto del componente proteica/concentrazione e inoltre componente sequenziale molto più complicato.

Utilizzando questa camera aperta, abbiamo modellato anche il supporto dei planar lipidici mediante il quale uno può sondare come geometriche confini influenza modello formazione²¹, un fenomeno che ha recentemente stato anche studiato in vivo utilizzando batteri modellato in microstrutture⁷. Abbiamo impiegato anche questo test per studiare mutazioni come sono definite nella mia formazione di pattern di effetto del sistema²⁰. Inoltre, lo stesso formato di base di analisi è stato impiegato per indagare come la formazione di pattern può essere controllato dalla luce, introducendo un peptide di miniera azobenzene-reticolato il dosaggio e di imaging con TIRF microscopia²⁴.

Abbiamo trovato che, al fine di replicare il modello MinDE formazione osservata in vivo in un confinamento di sistema, in vitro è stata la chiave. Consentito l'utilizzo di asta-a forma di microcompartments, con dimensioni regolati alla lunghezza d'onda più grande di MinDE in vitro (10 x 30 µm), rivestito con un doppio strato lipidico supportati la ricostituzione delle oscillazioni di poli-poli MinDE e formazione di gradienti della proteina ^10,25. In questa analisi, i lipidici supportati sono depositati su un substrato PDMS fantasia che contiene repliche diverse centinaia di microcompartments a forma di bastoncello che rimangono aperti in alto a sinistra. In questo modo, la reazione può essere impostata in una camera aperta, e successivamente il buffer viene abbassato al bordo del microcompartments, limitando quindi la reazione di un piccolo volume. Anche se questi scomparti hanno un'interfaccia aria-buffer su un lato e quindi non rappresentano un confinamento 3D completo di membrana, le dinamiche di proteina ha imitato in vivo oscillazioni^10,25. Rispetto al confinamento 3D completo, che mostra molto simili risultati¹⁸, l'analisi di microstrutture aperto è relativamente semplice e facile da gestire e può essere eseguita anche da laboratori che non sono dotati di attrezzature specializzate microfluidica e Servizi in camera pulita.

Qui, presentiamo un protocollo sperimentale per la ricostituzione MinCDE formazione di pattern su supportato dei lipidi bilayer in vitro utilizzando una camera aperta che permette di controllare tutti i componenti e facile accesso mediante microscopia ottica e, con minore modifiche, inoltre è adattabile per tecniche di superficie-sonda²⁶. Accanto a planare lipidici supportati, mostriamo anche come confinamento della proteina può essere ottenuto utilizzando lipidici supportati fantasia semplice su asta-a forma di microstrutture PDMS. Queste analisi, anche se ottimizzato per il sistema di MinCDE, possono essere trasferite anche ad altri sistemi di proteine che interagiscono in modo simile con la membrana, ad esempio FtsZ²⁷ o una corteccia di actina minimo²⁸.

Protocol

1. proteina produzione

1. Espressione della proteina
   1. Trasformare e. coli BL21 (DE3) pLysS con il plasmide rispettivo per espressione della mente⁶, EGFP-mente²⁹, mRuby3-mente²⁴, miniera⁶ o MinC³⁰. Per le mappe di plasmide, vedere informazioni supplementari.
   2. Inoculare una cultura pernottamento in LB medium con una singola Colonia utilizzando i rispettivi antibiotici (ad es.,100 µ g/mL di ampicillina o kanamicina 50 µ g/mL) e incubare a 37 ° C per 14-16 ore agitando.
   3. Inoculare in 500 mL di mezzo di TB contenente l'antibiotico rispettivo con la cultura durante la notte (diluizione 1: 200) e incubare la coltura a 37 ° C mentre si stringono a 180 giri/min.
   4. Indurre l'espressione della proteina con l'aggiunta di 0,5 mM IPTG quando la cultura raggiunge una densità ottica a 600 nm di 0.5-0.7. In caso di EGFP-mente o mRuby3-mente, spostare le celle di un incubatore con 16 ° C e far crescere cellule per 14-16 h e in caso di MinC, mente o la mia, far crescere cellule per 3-4 ore a 37 ° C dopo induzione.
      Nota: Induzione di MinC, mente o la mia espressione è tossico per le cellule, come risultati di sovraespressione nei difetti di divisione cellulare; quindi, è importante che il tempo di incubazione a 37 ° C è mantenuto sotto 4 h. Se sono necessario più proteine, aumentare la quantità di cultura, ma non il tempo di incubazione.
   5. Dopo tempo di incubazione rispettivi raccolgano le cellule mediante centrifugazione a 4000 x g per 10 min e memorizzare il pellet cellulare a-80 ° C fino a continuare ad utilizzarlo.
2. Purificazione della proteina
   Nota: Proteine possono essere purificate utilizzando preconfezionati Ni-NTA colonne su un sistema di purificazione di proteine automatizzati o usando i branelli Ni-NTA per purificazione di panca di gravitá.
   1. Per purificazione con colonne Ni-NTA preconfezionate su automatizzato proteina purificazione sistemi tampone di uso A1 (50 mM sodio fosfato pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazolo 10 mM), buffer B1 (50 mM sodio fosfato pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazolo 20 mM) e buffer C1 (sodio 50 mM fosfato pH 8.0, 500 mM NaCl, imidazolo 250 mM). Per la purificazione di panca di gravitá utilizzando Ni-NTA perline utilizzano buffer A2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, imidazolo 10 mM), B2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, imidazolo 20mm) del buffer e buffer C2 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, imidazolo 250 mM). Integrare tutti i buffer con ß-mercaptoetanolo 10 mM o 0,4 mM TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine) come agente riducente bene prima dell'uso.
   2. Risospendere le cellule in 20-30 mL di tampone A1 o A2 completati con EDTA senza inibitore della proteasi, 100 µ g/mL il lisozima, ~ 250 U/mL DNasi e 0,2 mM Mg^{2 +}- ADP (Mg^{2 +}- ADP in caso di purificazione mente o EGFP-mente solo, da un 100mm ADP a magazzino in 100 mM MgCl ₂ con pH regolato a 7.5).
   3. Lisare cellule utilizzando un sonicatore punta (30% ampiezza, 2,5 min, 30 impulsi s, 30 s spento), mantenendo il flaconcino contenente le celle in un bagno di ghiaccio.
   4. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione la cella lysata per 45 min a 25.000 x g a 4 ° C.
   5. Incubare il surnatante su colonna Ni-NTA o Ni-NTA perline.
      1. Per le colonne di Ni-NTA preconfezionate, caricare il campione sulla colonna utilizzando la pompa di campionamento di un sistema di purificazione di proteine automatizzato.
      2. Per la purificazione di banco, incubare il campione con perline di Ni-NTA in una provetta di reazione 50 mL su un agitatore rotante a 4 ° C per 1 h. Per i passaggi successivi, trasferire le perline di Ni-NTA in una colonna vuota usando una pipetta 25 mL.
   6. Lavare con almeno 5 colonna volumi di buffer A1 o A2.
   7. Lavare con almeno 5 colonna volumi di buffer B1 o B2.
   8. Eluire la proteina con buffer C1 o C2.
   9. Valutare la purezza della proteina tramite SDS-PAGE.
   10. Opzionale: Purificare ulteriormente proteina applicandolo ad una colonna di gel filtrazione equilibrata in tampone di deposito (50 mM HEPES/KOH pH 7.2, 150 mM KCl, 10% glicerolo, 0.1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP, (mM 0,2 Mg^{2 +}- ADP in caso di mente)).
       Nota: Gel filtrazione è consigliato per la mente rimuovere la frazione proteica aggregati.
   11. Se nessun gel-filtrazione è impiegato, scambio di tampone di eluizione Ni-NTA per tampone di deposito (50 mM HEPES/KOH pH 7.2, 150 mM KCl, 10% glicerolo, 0.1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP, (mM 0,2 Mg-ADP in caso di mente)) utilizzando una gravità flusso di dissalazione colonna (Vedi Tabella materiali).
   12. Congelamento proteine in aliquote in azoto liquido e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo ulteriore.
   13. Misurare la concentrazione di stock di proteine usando analisi di Bradford e determinare l'attività della proteina con un dosaggio di ATPasi²⁰.
       Nota: Non valutare la concentrazione di proteina mediante assorbimento a 280 nm. La presenza di nucleotide durante la purificazione della mente e la mancanza di tryptophans nella mia distorcere una misura di concentrazione di₂₈₀ . Uso Bradford o BCA dosaggi per misurare le concentrazioni di proteina invece.
3. Contrassegno della proteina
   Nota: La fusione di una proteina fluorescente per la piccola proteina miniera induce importanti cambiamenti alle relative proprietà diffusiva e funzione; quindi, etichettatura chimica della proteina (cisteina alla posizione 51) è preferito sopra fusione di proteine fluorescenti.
   1. Sciogliere 0,125 mg di maleimide-tintura coniugato in 5-10 µ l di DMSO (dimetilsolfossido) e aggiungere sotto agitazione per un mL 0,5 mio aliquota nel buffer di memoria a pH 7,2, preparato come descritto sopra.
   2. Incubare per 2 ore a tutta la notte a 4 ° C o 2 h a RT sotto agitazione delicata o agitazione.
   3. Colorante separata e proteina usando un flusso di gravità desalificazione colonna equilibrata con buffer di memoria (50 mM HEPES/KOH a pH 7.2, 150 mM KCl, 10% glicerolo, 0.1 mM EDTA, 0,4 mM TCEP).
   4. Per più ulteriormente rimuovere qualsiasi colorante non collegato, Dializzare la proteina contro un eccesso di buffer di memoria.
   5. Verificare successo etichettatura misurando l'estinzione al massimo per il rispettivo colorante e calcolare l'efficienza di etichettatura stimato. Fare riferimento alle istruzioni del produttore della tintura per un protocollo dettagliato sulla stima del grado di etichettatura. Analizzare con SDS-PAGE e determinare la spettrometria di massa di massa totale per ulteriori utili informazioni sull'omogeneità del campione e il successo d'etichettatura.

2. piccole vescicole unilamellari (SUV) preparazione

1. Generazione delle vescicole multilamellari
   1. Calcolare la quantità di lipid(s) in cloroformio per la vostra miscela desiderata e il volume finale di SUV. La concentrazione deve essere di 4 mg/mL di lipidi in tampone a Min (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM KCl, 5 mM MgCl₂). Per un'analisi standard di Min si consiglia una miscela di 7:3 DOPC:DOPG (% mol). Quando utilizzando dei lipidi polari di e. coli estrarre, utilizzare buffer di SLB (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM KCl) per tutte le fasi di preparazione.
      Nota: Non è consigliabile per la prima volta gli utenti di utilizzare Estratto di e. coli dei lipidi polari come la generazione di SLBs omogenea con questa miscela è molto più impegnativo.
   2. Utilizzando una pipetta volumetrica con punte di vetro, mescolare i lipidi in cloroformio in un flaconcino di vetro da 1,5 mL.
      1. Asciugare i lipidi sotto un flusso di azoto leggero ruotando lentamente il flaconcino. Posizionare i lipidi sotto un forte flusso di azoto per 10-20 minuti. Collocare il flaconcino contenente il film lipidico secchi in un essiccatore sotto vuoto e applicare il vuoto per almeno 1 h.
   3. Reidratare i lipidi nel buffer di Min nel Vortex a temperatura ambiente fino a quando l'impasto è omogeneo opaco.
      Nota: Per la generazione delle vescicole unilamellari piccole dalle vescicole multilamellari, lipidi possono sia essere estruso come descritto al punto 2.2. o lisati mediante come descritto al punto 2.3. In generale, estrusione produce una distribuzione di dimensione minore larghezza che può aiutare con la formazione di lipidici supportati.
2. Preparazione di SUV per estrusione
   1. Rompere gli aggregati lipidici e strutture multilamellari e ulteriormente solubilizzare i lipidi di congelamento-scongelamento per 7-10 cicli.
      1. Preparare un bicchiere con acqua a 70° C a 99° C su un piatto caldo e un contenitore con azoto liquido.
      2. Tenere il flaconcino nell'azoto liquido con pinzette grande fino a quando l'azoto si ferma bollente. Quindi trasferire il flaconcino per acqua calda fino a che la soluzione è completamente sciolto. Ripetere questi passaggi fino a quando la miscela di lipidi appare chiaramente visibile, a seconda della miscela.
   2. Assemblare un estrusore di lipidi e pre-risciacquo del sistema con buffer di Min. Estrudere la miscela di lipidi tra 35 e 41 volte attraverso una membrana di formato del poro di 50 nm. Assicurarsi che alla fine su un numero dispari di pass per evitare aggregati che mai attraversare la membrana.
3. Preparazione di SUV di sonicazione
   1. Per meglio sciogliere i lipidi nel buffer, mettere il flaconcino di vetro contenente la soluzione in un blocco di calore impostato a 37 ° C e vortexare ogni 20 minuti per 1 minuto. Incubare in totale per circa 1 h.
   2. Immergere il fondo del flaconcino in un bagno sonicatore (in quest'opera 1,91 L, 80 W) collegando il flaconcino su uno stand per morsetto all'altezza desiderata.
   3. Impostare l'altezza dell'acqua nel bagno sonicatore, in modo che la soluzione che circondano il flaconcino è accuratamente agitata dagli impulsi e Sonicare la miscela di lipidi per circa 20 minuti. Verifica per sonicazione successo valutando la chiarezza dei lipidi.
4. SUV può essere conservato a 4 ° C per fino ad una settimana o congelato a-20 ° C in piccole aliquote (~ 20 µ l) e per diverse settimane. Scongelare fiale o provette a temperatura ambiente e Sonicare nuovamente come descritto nella sezione 2.2.3 o 5.3 fino a quando la soluzione è limpida, prima SUV l'utilizzo per la preparazione di supportato lipidici (SLBs). Si prega di notare che la distribuzione delle strette dimensioni dei SUV ottenuta per estrusione è perso dopo congelamento e scongelamento e sonicazione.

3. pulizia vetrini coprioggetti

Nota: Pulizia e idrofilizzazione di vetrini coprioggetti è un fattore importante per lipidici supportati omogenea e fluida. Lamelle di vetro possono essere pulite usando una soluzione piranha, fatta da un rapporto di 7:2 acido solforico al 50% di perossido di idrogeno (3.1), o con un plasma di ossigeno in un plasma cleaner (3.2). Entrambi i metodi producono risultati simili.

1. Piranha pulizia dei vetrini coprioggetti
   1. Applicare la soluzione piranha
      1. Distribuire le lamelle di vetro su una capsula di Petri vetro invertito o altra superficie inerte. Con una pipetta di vetro, aggiungere 7 gocce di acido solforico concentrato (98%) al centro di ogni vetrino coprioggetti.
         Attenzione: l'acido solforico è fortemente acidi e corrosivi. Lavorare in una cappa e con dispositivi di protezione appropriati.
      2. Aggiungere due gocce di perossido di idrogeno 50% alla metà delle gocce d'acide.
         Attenzione: perossido di idrogeno è corrosivo per gli occhi e la pelle.
      3. Coprire la reazione ed incubare per almeno 45 minuti.
         Nota: Il tempo massimo di attesa qui non è fondamentale per l'esito dell'esperimento e può essere esteso fino a diversi giorni.
   2. Piranha Wash puliti coprioggetti.
      1. Pick up i coprioggetti singolarmente utilizzando pinzette e lavare via l'acido con acqua ultrapura. Posto i coprioggetti lavati in antiaderente titolari o analogo dispositivo di trasporto.
      2. Ogni vetrino coprioggetti estesamente con acqua ultrapura di sciacquare e asciugare la superficie con gas pressurizzato (azoto, aria solo se privo di olio). Contrassegnare il lato pulito del coprivetrino con pennarello indelebile.
2. Pulizia al plasma di vetrini coprioggetti
   1. Sciacquare le lamelle con etanolo in eccesso ed in seguito con acqua ultrapura in eccesso. Asciugare i vetrini coprioggetti con gas pressurizzato. Assemblare la camera come descritto in 4.
   2. Dopo il montaggio della camera come descritto in 4 Prendete i coprioggetti con annesso camera e posto nel plasma cleaner con ossigeno come gas di processo. Pulire le lamelle con plasma (in questo potere di 30% di lavoro, è stato utilizzato 0,3 mbar pressione di ossigeno per 1 min). Fare le pulizie in prima formazione SLB come descritto in 5, come l'effetto idrolizzante di pulizia al plasma svanisce nel tempo.
      Nota: Timing e la potenza di pulizia al plasma dovrebbe essere ottimizzati utilizzando membrane fluorescente contrassegnate, come troppo poco o pulizia al plasma eccessiva può portare entrambi a membrane immobile o membrane con fori.

4. camera di

1. Con forbici affilate, tagliare ed eliminare il coperchio e la parte conica di un tubo di reazione 0,5 mL. Applicare colla UV al bordo superiore del tubo e distribuire in modo uniforme utilizzando un puntale.
2. Incollare il tubo testa in giù per il coprioggetto precedentemente pulito. In caso di piranha pulizia assicurarsi di colla sul lato pulito del vetro. Curare la colla UV posizionando più alloggiamenti sotto una 360 nm lampada o LED per 5-15 minuti.

5. formazione (SLB) Bilayer del lipido supportati

1. Pre-riscaldare il blocco riscaldante a 37 ° C ed incubare le provette di reazione di 2 mL con buffer di Min o SLB, 1 tubo per camera.
2. Azoto di colpo negli alloggiamenti assemblati e curati per rimuovere eventuali tracce di polvere o altre particelle che possono hanno depositato durante la reticolazione UV-indotta e l'assemblaggio. Al plasma pulito come descritto al punto 3.2, se non dopo avere ripulito i coprioggetti con soluzione Piranha (3.1). Inserire chambers sul blocco di calore.
3. Diluire un'aliquota di 20 µ l di lipidi chiari (a 4 mg/mL) con 130 µ l di tampone di Min o SLB buffer in caso di Estratto di lipidi polari di e. coli , producendo una concentrazione di lavoro di 0,53 mg/mL. Nel caso in cui i lipidi sono stati congelati, Sonicare prima tenendo il tubo in un sonicatore vasca prima di aggiungere buffer, quindi sottoporre ad ultrasuoni nuovamente con il tampone.
4. Aggiungere 75 µ l di miscela del lipido per ogni camera e impostare un timer di 3 minuti (per le miscele DOPC/DOPG; incubazione più lungo potrebbe essere necessaria per altre miscele del lipido). In caso di e. coli Estratto dei lipidi polari, pipettare CaCl₂ da uno stock di 100 mM in aula per una concentrazione finale di 3 mM. Durante il periodo di incubazione, le vescicole scoppiano sulla superficie del vetro idrofilo e fondono per formare un SLB coerente.
5. Dopo 60 secondi, aggiungere 150 µ l di tampone di Min per ogni camera.
6. Le camere di lavaggio: dopo un altro 120 secondi (3 minuti in totale) lavare ogni alloggiamento di aggiungere 200 µ l di tampone di Min o SLB, attentamente pipettaggio fino e giù un paio di volte, la rimozione e l'aggiunta di un altro 200 µ l.
   1. Dopo ogni alloggiamento è stato lavato una volta, procedere a lavare accuratamente il primo alloggiamento fino a quando non vengono utilizzati i 2 mL di tampone. Lavaggio delle SLBs ha bisogno di qualche esperienza di perfezionare nella misura dei moti in aula e trovare l'intensità di lavaggio corretto.
      Nota: Non rimuovere mai tutto il liquido dalla camera per evitare l'essiccamento di SLB.
      Nota: In cima lavaggio, proprietà della membrana variano a seconda di molti fattori aggiuntivi: tipo di lipidi e loro relative concentrazioni in miscela di lipidi, metodo di preparazione per i SUV, trattamento superfici e previa pulizia del supporto.

6. auto-organizzazione Assay

1. Regolare volume tampone nella camera a 200 µ l di tampone di Min meno la quantità di proteina e soluzione di ATP, quindi aggiungere la mente, mente, con l'etichetta della miniera e, se lo si desidera, MinC. Mescolare delicatamente i componenti di pipettaggio. Esempio le concentrazioni sono 1 µM mente (drogato con 30% EGFP-mente), 1 µM miniera (drogato con 10% chimicamente etichettato miniera) e 0,05 µM MinC, ma modelli formano sopra una gamma di concentrazioni^6,10,20,30 .
2. Aggiungere 2,5 mM ATP (da stock di ATP di 100 mM a 100 mM MgCl₂, pH 7.5) per avviare l'auto-organizzazione di MinDE.
   Nota: L'ordine di aggiunta componente (mente, MinE e ATP) può essere variata e non influenzerà il risultato finale modello⁴.
3. Osservare MinDE autorganizzazione il microscopio di fluorescenza (Vedi Tabella materiali). MinDE autorganizzazione può essere osservato anche usando la microscopia TIRF. Per l'imaging di eGFP-mente, utilizzare un laser di Argon 488 nm o laser a diodi comparabili (ad es., 490 nm). Per formazione immagine mRuby3-mente, è meglio impiegare un diodo laser 561 nm.
   Nota: Evitare di alti livelli di eccitazione per tempi più lunghi come noi e altri¹⁷ sono osservati fototossicità in del sistema MinDE, portando a polimerizzazione irreversibile della proteina sulla membrana.

7. microstrutture PDMS

Nota: PDMS (polidimetilsilossano) è un polimero che può essere utilizzato per la produzione di microstrutture e dispositivi microfluidici. Un wafer di silicio a motivi serve come uno stampo per la fusione delle strutture PDMS. Le strutture PDMS quindi fungono da supporto per la formazione di SLB e installazione di analisi.

1. O produrre wafer di silicio con microcompartments mediante fotolitografia (Vedi Zieske e Schwille per un dettagliato protocollo³¹ o Gruenberger et per un video protocollo³²) oppure ordinare il wafer di silicio desiderato da una fonderia . Per il modello dei wafer utilizzati nel presente documento vedere informazioni supplementari.
2. Produzione di microstrutture PDMS da wafer di silicio a motivi.
   1. Utilizzare un bicchiere di plastica per pesare 10 g di PDMS base e 1 g di PDMS reticolante. O utilizzare un dispositivo di miscelazione per mescolare e degassare la miscela PDMS o mescolare manualmente il PDMS e quindi degassare sotto vuoto.
   2. Utilizzare una pipetta per cadere una piccola quantità di PDMS direttamente sulla struttura sul wafer di silicio.
      Nota: Fare attenzione a non graffiare il wafer di silicio.
   3. Immediatamente porre un coprivetrino #1 sulla goccia PDMS e prendere l'estremità superiore di una pipetta pulita per premere delicatamente il vetrino coprioggetto sul wafer di silicio. Il PDMS dovrebbe essere diffondere sottilmente tra il vetrino coprioggetto e i wafer di silicio.
   4. Inserire la cialda con lamelle in un forno e curare il PDMS per 3-4 ore o durante la notte a 75 ° C. Rimuovere la cialda dal forno e lasciate raffreddare a temperatura ambiente. Con una lama di rasoio, rimuovere accuratamente il vetrino coprioggetto con il PDMS allegata dal wafer SI.
      Nota: Per evitare il wafer di silicio da ottenere sporco o danneggiato, coprire sempre le microstrutture con PDMS e un vetrino coprioggetti. Tuttavia, Evo PDMS, provocando crepe nelle microstrutture, quindi non utilizza strutture PDMS che risalgono a più di due o tre settimane.

8. auto-organizzazione in microstrutture PDMS

1. Utilizzare vetrini coprioggetti con microstrutture PDMS a fissare una camera come descritto sotto i 4 anni.
2. Pulire e idrofilizzazione superficie in un plasma ad ossigeno pulito come descritto al punto 3.2.2. Fare i substrati PDMS puliti di non piranha.
3. Impostare un'analisi di auto-organizzazione di MinDE come descritto al punto 6.
4. Dopo aver impostato il dosaggio, controllare per regolare formazione di pattern MinDE e microstrutture adeguatamente formate il microscopio di fluorescenza.
5. Quando schemi regolari MinDE hanno formato (10-30 min), pipettare delicatamente su e giù due volte per miscelare i componenti e quindi rimuovere il buffer passo dopo passo di pipettaggio. Rimuovere la massa di grandi dimensioni di usando una pipetta a 100 µ l di tampone e quindi rimuovere delicatamente il resto usando una pipetta di 10 µ l.
   Nota: Questo passaggio potrebbe essere necessario un po' di pratica. Se troppo buffer è tolto o il processo richiede troppo tempo, le microstrutture saranno asciugate fuori; Se troppo poco è presa, le proteine non si limiterà a microstrutture, ma continuano a formare onde di superficie in viaggio.
6. Immediatamente chiudere la camera con un coperchio per evitare l'essiccamento del buffer residuo in microstrutture.
7. Per consentire tempi di imaging, collegare un pezzo inumidito di spugna all'interno della camera e poi chiudere con il coperchio. Assicurarsi che la spugna non tocchino la superficie del coprivetrino.
8. Prima di formazione immagine dell'assegno microstrutture sulla superficie che il buffer è stato abbassato abbastanza, così che nella superficie sopra la formazione di pattern di microstrutture MinDE è stato interrotto. MinDE oscillazioni in microstrutture della battuta. Controllare che le microstrutture non sono asciugate o stanno asciugando durante la formazione immagine.
   Nota: Smaltire coprioggetti con microcompartments dopo ogni uso, crepe nel modulo PDMS.

9. analisi della formazione di pattern MinDE

1. Quantificare la lunghezza d'onda, velocità di onda e onda profili auto-dell'organizzazione MinDE su lipidici supportati planare. FIJI con il set standard di plugin confezionato è sufficiente per analisi di base³³.
2. Analizzare Polo-Polo oscillazioni in microcompartments ottenendo chimografi e profili di concentrazione di proteina mediato nel tempo. Chimografi base possono essere ottenuti mediante ri-tranciatura di una serie di tempo insieme ad una selezione di linea in FIJI.

Results

Purificazione della proteina seguendo il nostro protocollo dovrebbe produrre proteine Min di purezza adeguata. Come riferimento, la Figura 1 fornisce un'immagine di SDS-PAGE della mente, fluorescente etichettati mente, MinE e MinC. I singoli passaggi della procedura per eseguire un test di auto-organizzazione di MinDE su non-fantasia lipidici supportati sono descritti nella Figura 2. Usando questo protocollo, regolari MinDE viaggiare le onde di superficie possa essere osservati durante l'alloggiamento (Figura 3). La lunghezza d'onda può variare leggermente all'interno della camera, ma in generale i modelli sembrano simili. I bordi della camera non dovrebbero essere utilizzati per confronti quantitativi, come membrane che forma sulla colla UV sembra avere proprietà diverse rispetto sul vetro di superficie (vedere Figura 3). Le onde di superficie itinerante possono essere analizzate tracciando l'intensità lungo la direzione di propagazione (Figura 3B). Mentre mente fluorescenza altipiani piuttosto veloce dal bordo superiore dell'onda e quindi diminuisce bruscamente sul bordo d'uscita, miniera fluorescenza aumenta quasi linearmente dall'inizio dell'onda mente e raggiunge il suo massimo dopo mente sul bordo d'uscita, dove si si stacca nettamente⁶.

Accanto alla qualità delle proteine, la qualità della lipidici supportati è più critica per una regolare auto-organizzazione dei MinCDE. Da un lato se la membrana viene lavata troppo eccessivamente o la superficie sottostante è stata pulita e così addebitata troppo fortemente, possono formare fori nella membrana (Figura 6A, parte superiore). D'altra parte se la membrana non è lavata correttamente o la superficie sottostante non è pulita, idrolizzato, vescicole che si attaccano alla membrana o sarà compromessa la fluidità di membrana (Figura 6A, in basso). Anche se non così evidente come quando si osserva la membrana direttamente via con etichettati lipidi, questi problemi possono essere rilevati anche dal segnale di fluorescenza di mente, come modelli non sono regolari e la fluorescenza nei massimi non è omogenea ma contiene "buchi" o punti luminosi come mostrato nel pannello centrale della Figura 6A.

Per auto-l'organizzazione di MinDE in asta-a forma di microstrutture PDMS la procedura è riassunto nella Figura 4. Diversi passaggi di protocollo non devono essere ripetute, come proteine e lipidi possono essere riutilizzati. Come su substrati non-fantasia, il substrato viene pulito e idrolizzato (di pulizia al plasma), un doppio strato lipidico supportati è formata sul PDMS e il test di auto-organizzazione è impostato in un volume di 200 µ l. Per verificare che si è formata una membrana corretta e MinDE auto-organizza sulla membrana, gli alloggiamenti sono Imaging. Quando una membrana corretta è stata formata, MinDE forme regolari viaggio onde superficiali sulla superficie del PDMS tra le microstrutture individuali e anche auto-organizza in fondo le microstrutture come le onde possono liberamente muoversi sopra l'intero superficie ricoperta di membrana (Figura 5A). Dopo la rimozione del tampone, la superficie tra i comparti non dovrebbe mostrare alcun pattern MinDE moltiplicazione (figura 5B), come dovrebbe essere completamente asciutto. Se MinDE modelli sono ancora in movimento, più buffer deve essere rimosso. Le proteine sono ora confinate nel microcompartments a forma di bastoncino il PDMS rivestito di membrana ed aria sull'interfaccia superiore (Figura 5), in cui self organizzeranno. In queste condizioni le due proteine possono eseguire Polo-Polo oscillazioni come mostrato in Figura 5. Come una frazione della mente e la mia è sempre legata alla membrana, anche durante la rimozione del tampone, le concentrazioni dopo la rimozione del tampone non sono paragonabili a concentrazioni di input. A causa di questo effetto le concentrazioni variano anche tra singole microstrutture il coprivetrino stesso come essi dipendono dalla posizione dei modelli prima della rimozione del tampone. Produzione di wafer di silicio o PDMS stampaggio da wafer di silicio può causare microstrutture incomplete che non possono essere utilizzate per l'analisi (Figura 6B). Inoltre, a causa del buffer microstrutture di rimozione potrebbero asciugarsi durante il processo e quindi, dovrebbero essere esclusi dall'ulteriore analisi (Figura 6B). Di conseguenza solo una frazione di microstrutture in uno alloggiamento Mostra le oscillazioni di Polo-Polo desiderate. Per analizzare le dinamiche di proteina in microstrutture, un kymograph può essere ottenuta disegnando una selezione su tutta la struttura (Figura 5E). Quando MinCDE oscillare da Polo a Polo, MinC e mente mostrerà un gradiente di concentrazione mediato nel tempo con la massima concentrazione ai poli di vano e concentrazione minima al centro del vano (Figura 5F).

Figura 1: SDS-PAGE mostrando i prodotti finali di purificazioni proteina. Sua mente (33,3 kDa), His-eGFP-mente (60,1 kDa), His-mRuby3-mente (59,9 kDa), His-miniera (13,9 kDa) e His-MinC (28,3 kDa) sono mostrati in ordine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: diagramma di flusso del processo mostrando i singoli passaggi e la tempistica del protocollo per un auto-organizzazione su lipidici con motivi non supportati (passi 1-6). Caselle tratteggiate indicano che una di queste due opzioni può essere utilizzata per la pulizia. Le frecce contrassegnate dai cerchi indicano dove il protocollo può essere sospesa e ripresa successivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Imaging di MinDE analisi mediante microscopia confocale a. A) a spirale regolare Min, da quale velocità di propagazione, la trama di intensità e la velocità possono essere ottenute misurazioni. Concentrazioni usate: 0,6 µM mente (30% eGFP-mente), 1,8 µM His-miniera (30% sua-miniera-Alexa647) B) esempio grafico di intensità normalizzata per la regione segnata in r. C) Panoramica della camera di dosaggio intero (barra della scala: 1mm, stesse concentrazioni di proteina come sopra). Spirali o senso di rotazione così come modelli di destinazione possono essere osservati. La regione ingrandita Mostra come onda modelli differiscono sulla UV-colla. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: diagramma di flusso del processo mostrando i singoli passaggi e la tempistica del protocollo per l'auto-organizzazione in asta-a forma di microstrutture (passi 1-5, 7, 8). Caselle grigie indicano passaggi dove i prodotti possono essere riutilizzati dal protocollo su lipidici con motivi non supportati. Le frecce contrassegnate dai cerchi indicano dove il protocollo può essere sospesa e ripresa successivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: risultati rappresentativi per MinDE modello formazione in asta-a forma di microcompartments PDMS. A) MinDE auto-organizzarsi sulla superficie del PDMS formando onde di superficie in viaggio (1 µM mente (30% EGFP-mente), 2 µM miniera e 2,5 mM ATP). B) dopo il buffer è abbassato all'altezza di microstrutture, l'auto-organizzazione della proteina si interrompe sulla superficie planare tra il microcompartments. C) schematica di un asta-a forma di microcompartment. D) immagini rappresentative delle oscillazioni di poli-poli MinDE dopo la rimozione del tampone. E) Kymograph delle oscillazioni lungo la riga evidenziata indicata in D). F) immagine e il profilo dell'intensità di fluorescenza media della serie tempo mostrato nella D) mostrando chiaramente il gradiente della proteina che è massima ai poli microcompartment e minima al centro del vano. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: esempi di risultati sperimentali negativi. A) membrane over-lavate si accumulano fori, mentre preparazioni suboptimali della vescicola e composizioni lipidiche conducono ad attaccare le vescicole. I pannelli del due centro mostrano una combinazione di entrambi i problemi e come diventano visibili quando si osservano oscillazioni Min. Le membrane sono state etichettate con 0.05% Atto655-DOPE. (scala bar: 50 µm) B) pannello superiore: seccava microcompartments può essere causato da troppo rimozione di buffer o quando il buffer si volatilizza nel corso del tempo. Pannello di fondo: scomparti Incomplete possono formarsi durante la produzione di wafer o stampaggio PDMS. (scala bar: 30 µm) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementari 1: Mappa di plasmide per la sua mente. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 2: Mappa di plasmide per sua-EGFP-mente. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 3: Mappa di plasmide per sua-mRuby3-mente. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 4: Mappa di plasmide per la sua miniera. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 5: Mappa di plasmide per sua MinC. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

File supplementari 6: File CAD per wafer di silicio di microcompartments a forma di bastoncello. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Abbiamo descritto un protocollo per la ricostituzione in vitro di MinCDE auto-organizzazione su facce planari supportato lipidici e lipidici a doppio strato coperto strutture 3D, utilizzando l'esempio di asta-a forma di microstrutture PDMS. Al fine di ottenere dati importanti da queste analisi, i fattori più importanti da controllare sono qualità della proteina e della membrana.

Per garantire la qualità delle proteine, proteine massa dovrebbe essere confermato mediante SDS-PAGE e spettrometria di massa. Inoltre, occorre verificare che le proteine siano solubili e non aggregati, mediante cromatografia analitica o la dispersione della luce dinamica. Gel filtrazione può essere utilizzato per rimuovere qualsiasi frazione di aggregati di proteine. Regolazione del pH attenzione e qualità di nucleotidi aggiunto è critica, come l'aggiunta di nucleotidi non rettificati o parzialmente degradato alla proteina scorte o auto-organizzanti saggi è sufficiente ad eliminare l'attività della proteina, quindi abolizione auto-organizzazione.

Accanto alla qualità delle proteine, qualità di membrana è più critica e formazione impropria della membrana è più spesso la causa per difettosi auto-organizzazione e l'origine delle strutture superficiali artefactual.

Quando si esegue il protocollo per la prima volta, è utile etichettare i lipidici supportati includendo lipidi etichettati come Atto-655-DOPE o DiI a basse percentuali di molare (0,05%). Quindi la proprietà e la qualità della membrana può essere giudicati direttamente. Utilizzando FRAP, la fluidità della membrana può essere valutata. Inoltre, uno può valutare direttamente la qualità del lavaggio dei SLB, come ci può essere troppo molte vescicole, nessuna membrana fluida o nessuna membrana affatto, se esso è stato lavato. L'approccio di camera aperta permette di lavare rigorosamente la membrana e quindi anche per rimuovere le vescicole che stanno attaccando sulla superficie di SLB. I fattori più importanti per l'ottenimento del lipido supportato fluido e omogeneo doppii strati sono la pulizia e l'idrofilia della superficie di appoggio e la corretta dimensione e omogeneità di SUvs può essere utile controllare la dimensione del SUV e dimensioni distribuzione utilizzando diffusione dinamica della luce. Per distribuzioni di dimensione stretta, consigliamo le vescicole di espulsione, piuttosto che sonicating li. Altri metodi di pulizia vetrini coprioggetti, ad esempio, trattamenti con basi forti, detergenti base o utilizzando vetrini coprioggetti direttamente dopo il risciacquo con acqua, possono produrre buoni risultati, a seconda della miscela del lipido e di applicazione.

La prima metà del protocollo presentato qui, la ricostituzione in vitro su lipidici supportati planare in aperta chambers, ha il vantaggio di rendere la superficie accessibile per microscopie ottiche, ad esempio TIRF microscopia³⁰, FRAP analisi⁶, singola particella³⁴, come pure la sonda per superfici tecniche quali la microscopia di forza atomica²⁶di rilevamento. La grande area omogenea consente migliori statistiche alle concentrazioni definite. L'approccio di camera aperta permette inoltre di controllare con precisione la concentrazione nella proteina e una rapida e semplice aggiunta di ulteriori componenti, permettendo quindi a titolare di concentrazione nella proteina in una singola camera²⁰. Il dosaggio può essere espanso con aggiunta di altri componenti batteriche divisome come FtsZ^22,35, ZipA²² o la proteina chimerica FtsZ-YFP-MTS^10,35.

Altri gruppi hanno adottato un approccio simile per ricostituire il Min sistema in vitro, ma utilizzare una cella di flusso invece di una camera aperta^17,18,19. Le cellule di flusso sono determinati vantaggi, in particolare quando un ambiente 3D completamente chiuso è necessario¹⁸, l'influenza di flusso^17,19,23 o membrana composizione²³ modelli di MinCDE è studiato, o se pattern proteici devono essere osservati sotto proteina limitando condizioni¹⁹. Tuttavia, il controllo locale delle concentrazioni molecolari è più difficile. Componenti proteiche, soprattutto la mente, si legano fortemente alla membrana incontrano prima^18,19. Nella nostra esperienza, le proteine esibiscono frequentemente legame non specifico alla tubazione, insenature, siringhe e altre parti di microfluidica. Quindi, le concentrazioni di proteina locale differiscono da concentrazioni ingresso¹⁸ e variano anche sopra la lunghezza della cella di flusso, causando una varietà di modelli differenti della proteina sulla membrana tra ingresso e uscita, come osservato da altri¹⁹.

La seconda metà del protocollo presentato qui, la ricostituzione in vitro in asta-a forma di microstrutture ri-utilizzando l'approccio di camera aperta su un supporto modellato coperto da lipidi bilayer permette per un semplice mimo di comportamento di proteina in vivo anche se un controllo preciso sulla concentrazione proteica viene perso a causa di rimozione del tampone. Si noti che perché la lunghezza d'onda di MinDE è circa un ordine di grandezza più grandi in vitro che in vivo l'asta-a forma di microcompartments sono anche circa un ordine di grandezza più grandi (10 x 30 µm) rispetto a un asta-a forma di e. coli di cella.

Nel complesso, questo protocollo consente il controllo preciso di tutte le condizioni compreso concentrazione proteica, buffer composizione e proprietà della membrana. L'utilizzo di supporti strutturati 3D consente la reazione essere studiato sotto confinamento spaziale, che imita il comportamento in vivo senza la necessità di apparecchiature complesse microfluidica.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DOPC	Avanti Polar Lipids	850375
DOPG Avanti	Polar Lipids	840475
E.coli polar lipid extract	Avanti Polar Lipids	100600
Adenosina 5′-trifosfato sale disodico triidrato	Roche
Adenosina 5′-difosfato sale monopotassico diidrato	Sigma	A5285-1G
Cloruro di sodio	VWR	27810.295
Cloruro di potassio	Roth	6781.1
Tris-base	Sigma Aldrich	T1503-1kg
Acido cloridrico	Roth	9277.1
TCEP-HCl	Termo Fisher Scientific	20491
Etilene Diammina Tetraacetato	Merck Millipore	1.08418.1000
Acido solforico 98%	Applichem	173163.1611
Perossido di idrogeno 50%	Applichem	147064.1211
HEPES	Biomol	05288.1
dimetil solfossido (DMSO)	Merck	102950	Uvasol
Glicerolo 86%	Roth	4043.1
TB medio
Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG)	Roth	2316.x
Atto-655-DOPE	Atto Tec	AD 655-161
Ni-NTA agarosio	Qiagen	30210
PDMS base	Dow Corning Corporation		SYLGARD 184
Reticolante PDMS	Dow Corning Corporation
Materiali
UV Colla	Norland Products	6801	#68 e #63 funzionano entrambi bene
Vetrini coprioggetti #1.5 24x24 mm	Menzel Glä ser
Vetrini coprioggetti #1 24x24 mm	Menzel Glä ser		utilizzato solo per microstrutture PDMS
Provetta di reazione da 0,5 ml	Eppendorf
coltura 0030123301 2L	Corning	, ad es. 734-1905
His-Trap HP	GE Healthcare Life Sciences
Colonna di gelfiltrazione: HiLoad Superdex 75 PG o 200 PG	GE Healthcare Life Sciences
desalinizzazione Econo-Pac 10DG Colonna preimpaccata	Biorad	7322010
dispositivo per dialisi: Cassette per dialisi Slide-A-Lyzer, 3,5K MWCO, 0,1 - 0,5 mL o 0,5-3 mL	Termo Fisher Scientific	66333 o 66330
lama di
Strumenti
acqua ultrapura: Sistemi di acqua ultrapura Milli-Q Tipo 1	Sistema
: Ä kta Pure	GE Healthcare Life Sciences
bagno, sonicatore	Branson		, ad esempio modello 1510
ARE-250, miscelatore	Thinky Corporation
Pulitore al plasma Zepto	Diener, uso elettronico		ossigeno come gas di processo
, pipette a spostamento positivo,	marca	Transferpettor, modelli
in vetroMicroscopio a scansione laser confocale LSM780	Zeiss		Dotato di obiettivo a immersione in acqua Zeiss C-Apochromat 40X/1.20
Plasmidi
pET28a-His-MinD_MinE	Dipartimento di Biofisica Cellulare e Molecolare, MPI di Biochimica, Prof. Schwille		plasmide codificante His-MinD e MinE non marcato per migliorare la resa
pET28a-His-MinE	Dipartimento di Biofisica Cellulare e Molecolare, MPI di Biochimica, Prof. Schwille		plasmide codificante His-MinE
pET28a-His-EGFP-MinD	Dipartimento di Biofisica Cellulare e Molecolare, MPI di Biochimica, Prof. Schwille		plasmide codificante His-EGFP-MinD
pET28a-His-mRuby3-MinD	Dipartimento di Biofisica Cellulare e Molecolare, MPI di Biochimica, Prof. Schwille		codificante plasmidi His-mRuby3-MinD
pET28a-His- MinC	Dipartimento di Biofisica Cellulare e Molecolare, MPI di Biochimica, Prof. Schwille		plasmide codificante per His-MinC