Vi tilbyr en protokoll for i vitro Self-Organization analyser og MinE på en støttet lipid bilayer i en åpen kammer. I tillegg beskriver vi hvordan du setter analysen i lipid-kledd PDMS microcompartments å etterligne i vivo forhold av reaksjon confinement.
Mange aspekter av grunnleggende spatiotemporal organiseringen av celler er underlagt reaksjon-diffusjon type systemer. In vitro rekonstituering av slike systemer gir detaljerte studier av deres underliggende mekanismene som ikke ville være mulig i vivo. Her gir vi en protokoll for i vitro rekonstituering av MinCDE systemet Escherichia colisom plasserer den celledeling septum midt cellen. Analysen er utformet for å levere bare de nødvendige komponentene for selvstendig organisasjon, nemlig en membran, to proteiner sinn og gruve og energi i form av ATP. Vi har derfor dikte en åpen reaksjon kammer på en dekkglassvæske, som en støttet lipid bilayer er dannet. Den åpne konstruksjonen av kammeret gir optimal utarbeidelse av lipid bilayer og kontrollert manipulering av bulk innholdet. To proteiner, sinn og MinE, samt ATP, legges deretter i bulk volum over membranen. Tenkelig er mulig med mange optisk microscopies, design støtter AC confocal, wide-field og TIRF mikroskopi alike. I en variasjon av protokollen, er lipid bilayer dannet på en mønstret støtte, på celle-formet PDMS microstructures, i stedet for glass. Senke bulk løsningen på kanten av seksjonene omslutter reaksjonen i et mindre rom og gir grenser at mimicking i vivo oscillasjon atferd. Sammen beskrive vi for å gjeninnføre MinCDE systemet både med og uten romlige confinement, slik at forskere til nettopp styre alle aspekter påvirke mønster formasjonen, som konsentrasjon områder og tillegg av andre faktorer eller proteiner, og systematisk øke systemet kompleksiteten i en relativt enkel eksperimentelle oppsett.
Spatiotemporal mønstre er avgjørende i naturen, regulere komplekse oppgaver både på flercellede og mobilnettet nivå, fra morphogenesis til regulert celledeling1,2. Reaksjon-diffusjon systemer spiller en viktig rolle i å etablere disse mønstrene, men er fortsatt ikke godt forstått. Et godt eksempel på en reaksjon-diffusjon system og de beste preget biologiske system er så langt Escherichia coli MinCDE system3,4,5,6,7. MinCDE systemet svinger fra cellen pole til celle pole E. coli å bestemme midten av cellen som fremtidig deling. Dette systemet er basert på ATPase sinnet, ATPase aktivere protein MinE, og membranen som en romlig reaksjon matrix8. MinC er ikke del av mønster formasjonen mekanisme, men er faktisk funksjonelle agent: en inhibitor av viktigste divisome protein FtsZ5,6. MinC binder til hjernen og derfor følger svingninger, noe som resulterer i en gjennomsnittlige protein konsentrasjon gradient maksimal ved celle polene og minimal cellen midt, kun tillater FtsZ å danner midcell9,10 . MinCDE systemet er en del av den større familien av Walker A ATPases som er nøkkelen til spatiotemporal organisasjonen i bakterier2, plassere og transportere protein komplekser11 og plasmider12 og regulerer celle divisjon13 og kromosom segregering14. Derfor MinCDE reaksjon-diffusjon systemet ikke bare representerer et arketypisk reaksjon-diffusjon system, men har også fått oppmerksomhet på grunn av dens relevans for spatiotemporal organisasjonen i bakterier.
Detaljert funksjonelle studier av MinCDE systemet i vivo er komplisert, manipulering av proteiner og gene sletting vanligvis føre celledeling defekter. Videre endre membran sammensetning eller egenskapene av stoffer i vivo er svært utfordrende15,16. Endringer i systemet og påvirke faktorer er vanskelig å tolke i komplekse miljøet i cellen, enda mer hvis det er forstyrret i en viktig funksjon som celledeling. Vi og andre har derfor slått til en i vitro rekonstituering tilnærming, redusere systemet til dens kjernekomponentene: Husk meg, ATP som energikilde og støttede lipid bilayer som en reaksjon matrix6,17, 18. dette bottom-up tilnærming kan undersøke mekanisme selvstendig organisasjon i detalj uten kompleksiteten av en levende celle. Skjemaet proteiner reise overflaten bølger6 og andre typer mønstre17,19 under disse forholdene, men med en bølgelengde det er vanligvis om en størrelsesorden større enn i vivo. Bruk av en åpen kammer muliggjør nøyaktig kontroll over alle aspekter påvirke mønster formasjon: protein konsentrasjoner6, protein egenskaper20, membran komposisjon10, buffer komposisjon og ATP konsentrasjon 6, samt tillegg av andre faktorer som trengsel agenter21 og andre divisome proteiner22. Sammenligning kan i vitro rekonstituering av MinCDE system i en flyt-cellen18,19,23 brukes å undersøke påvirkning av flyt17,23, protein begrense forhold19, membran komposisjon19 og full 3D confinement18 på protein mønstre, men gjengir en nøyaktig kontroll proteinkomponenter/konsentrasjon og sekvensiell komponent tillegg mye mer komplisert.
Bruker denne åpne kammer, vi også mønstret støtte fra planar lipid bilayers som man kan undersøke hvordan geometriske grenser innflytelse mønster formasjon21, et fenomen som har nylig også vært undersøkt i vivo bruker bakterier støpt inn microstructures7. Vi har også ansatt denne analysen til å undersøke hvordan definerte mutasjoner i min påvirker mønster dannelsen av systemet20. Videre har samme grunnleggende analysen format vært ansatt å undersøke hvordan mønster formasjon styres av lys, presenterer en azobenzene-krysskoblet MinE peptid i analysen, og tenkelig med TIRF mikroskopi24.
Vi fant at, for at MinDE mønsteret formasjon observert i vivo i en i vitro system, confinement var nøkkelen. Bruke stav-formet microcompartments, med dimensjoner justert til større bølgelengden til MinDE i vitro (10 x 30 µm), kledd med en støttet lipid bilayer tillatt rekonstituering MinDE Pol-til-Pol svingninger og protein gradient formasjon 10,25. I denne analysen, er støttede lipid bilayers avsatt på et mønstret PDMS substrat som inneholder flere hundre kopier av stav-formet microcompartments som forblir åpne på toppen. Med det reaksjonen kan settes opp i en åpen kammer, og senere bufferen er senket til kanten av microcompartments, og dermed avgrense reaksjonen til små. Selv om disse avdelingene har en luft-buffer-grensesnitt på den ene siden og dermed ikke representerer en full 3D confinement av membran, etterlignet protein dynamikken i vivo svingninger10,25. Sammenlignet med full 3D confinement, som viser svært like resultater18, åpen microstructures analysen er relativt enkel og lett å håndtere og kan også utføres av laboratorier som ikke er utstyrt med spesialiserte microfluidics utstyr og rent-rom fasiliteter.
Her presenterer vi en eksperimentell protokoll for gjenoppbygge MinCDE mønster formasjon på støttes lipid bilayers i vitro bruker en åpen kammer som gir kontroll over alle komponenter og enkel tilgang av optisk mikroskopi og, med mindre endringer, er også tilpasses overflaten-sonden teknikker26. Ved planar støttes lipid bilayers, vi også vise hvordan protein confinement kan være får enkel mønstret støttes lipid bilayers på stav-formet PDMS microstructures. Disse analyser, kan selv om optimalisert for MinCDE systemet, også overføres til andre protein-systemer som kommuniserer på en lignende måte med membran, som FtsZ27 eller en minimal begrepsordbok cortex28.
Vi har beskrevet en protokoll for i vitro rekonstituering av MinCDE selv-organisering på planar støttede lipid bilayers og i lipid bilayer dekket 3D strukturer, bruker eksemplet med stav-formet PDMS microstructures. For å få verdifulle data fra disse analyser, er de viktigste faktorene å kontrollere protein og membran kvalitet.
Å sikre protein kvalitet, protein masse skal bekreftes SDS side og massespektrometri. Videre må det bekreftes at proteiner er løselig og ikke aggregerte, ved hjelp av analytiske gel filtrering eller dynamisk lysspredning. Gel filtrering kan brukes til å fjerne alle aggregerte brøkdel av proteiner. Nøye pH justering og kvaliteten på ekstra nukleotider er kritisk, som i tillegg ikke-justert eller delvis forringet nukleotid protein aksjer eller selv-organisering analyser er tilstrekkelig til å eliminere protein aktivitet, derfor avskaffe Self-Organization.
Ved siden av protein kvalitet, membranen er mest kritiske og upassende membran formasjon er ofte årsaken defekt selv-organisering og opprinnelsen til artefactual overflaten strukturer.
Når du utfører protokollen for første gang, er det nyttig å merke støttes lipid-bilayers ved å inkludere merket lipider som Atto-655-DOPE eller DiI på lav molar prosenter (0,05%). Dermed kan egenskapene og kvalitet av membranen bedømmes direkte. Bruker FRAP, kan flyt av membranen vurderes. Videre kan en direkte vurdere kvaliteten på vask av SLB, som det vil enten være for mange blemmer, ingen væske membran eller ingen membran, hvis det har blitt vasket. Åpne kammeret tilnærming tillater å grundig vaske membranen, og dermed også for å fjerne blemmer som stikker på overflaten av SLB. De mest avgjørende faktorene for å få væske og homogen støttes lipid bilayers er rengjøring og hydrophilicity støtte overflaten og riktig størrelse og homogene SUvs kan det være nyttig å sjekke SUV størrelse og størrelse distribusjon ved hjelp dynamisk lysspredning. Smale størrelse distribusjoner anbefaler vi ekstrudering blemmer i stedet for å sonicating dem. Andre metoder for rengjøring coverslips, f.eks behandlinger med sterke baser, grunnleggende vaskemidler eller bruke coverslips direkte etter skylling med vann, kan gi gode resultater, avhengig av programmet og lipid blandingen.
Første halvdel av protokollen presenteres her, i vitro rekonstituering på planar støttes lipid bilayers i åpne chambers, har fordelen av gjengivelse overflaten tilgjengelig for optisk microscopies, som TIRF mikroskopi30FRAP analyse6, enkelt-partikkel sporing34, likeledes idet overflaten sonde teknikker som atomic force mikroskopi26. Stor homogen området gir bedre statistikk på definerte konsentrasjoner. Videre kan åpne kammeret tilnærming til nettopp styre protein konsentrasjon og en rask og enkel tillegg av flere komponenter, derfor tillater for å sjarmere protein konsentrasjon i en enkelt kammer20. Analysen kan også bli utvidet med tillegg av andre bakteriell divisome komponenter som FtsZ22,35, ZipA22 eller chimeric protein FtsZ-YFP-MTS10,35.
Andre grupper har tatt en lignende tilnærming til gjenoppbygge på Min systemet i vitro, men bruk en flyt-celle i stedet for en åpen kammer17,18,19. Flyt-celler har visse fordeler, spesielt når et innelukket 3D-miljø er nødvendig18, påvirkning av flyt17,19,23 eller membran komposisjon23 på MinCDE mønstre undersøkt, eller hvis protein mønstre er å bli observert under protein begrense forhold19. Likevel, lokale kontroll av molekylære konsentrasjoner er vanskeligere. Protein komponenter, spesielt sinn, sterkt binde til membranen de første møte18,19. I vår erfaring oppfører proteiner uspesifisert binding til rør, viker, sprøyter og andre microfluidic. Derfor lokale protein konsentrasjoner er forskjellig fra input konsentrasjoner18 og også variere over lengden av flyt-cellen, som resulterer i en rekke forskjellige protein mønstre på membranen mellom innløp og utløp, som observert av andre19.
Den andre halvparten av protokollen presenteres her, i vitro rekonstituering i stav-formet microstructures å bruke åpne kammeret tilnærming på en mønstret støtte dekket av lipid bilayers gir en enkel etterligne i vivo protein atferd Selv om nøyaktig kontroll over protein konsentrasjoner er tapt på grunn av buffer fjerning. Merk at fordi Bølgelengden av MinDE er om en størrelsesorden større i vitro enn i vivo stav-formet microcompartments er også om en størrelsesorden større (10 x 30 µm) enn en stav-formet E. coli celle.
Samlet gir denne protokollen presis kontroll over alle betingelser inkludert protein konsentrasjon, buffer komposisjon og membran egenskaper. Bruk av 3D strukturert støtter kan reaksjonen til studeres under romlige confinement, etterligne vivo virkemåte uten behov for komplisert microfluidics utstyr.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Michael Heymann og Frank Siedler for produksjon av silisium wafere, Core anlegget MPI-B for hjelp i protein rensing og Simon Kretschmer og Leon Harrington for kommentarer på manuskriptet.
Reagents | |||
DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
DOPG | Avanti Polar Lipids | 840475 | |
E.coli polar lipid extract | Avanti Polar Lipids | 100600 | |
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt trihydrate | Roche | ||
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate | Sigma | A5285-1G | |
Sodium chloride | VWR | 27810.295 | |
Potassium chloride | Roth | 6781.1 | |
Tris-base | Sigma Aldrich | T1503-1kg | |
Hydrochloric acid | Roth | 9277.1 | |
TCEP-HCl | Termo Fisher Scientific | 20491 | |
Ethylene Diamine Tetraacetate | Merck Millipore | 1.08418.1000 | |
Sulfuric Acid 98% | Applichem | 173163.1611 | |
Hydrogen Peroxide 50% | Applichem | 147064.1211 | |
HEPES | Biomol | 05288.1 | |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Merck | 102950 | Uvasol |
Glycerol 86% | Roth | 4043.1 | |
TB medium | |||
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Roth | 2316.x | |
Atto-655-DOPE | Atto Tec | AD 655-161 | |
Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
PDMS base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
PDMS crosslinker | Dow Corning Corporation | ||
Materials | |||
UV Glue | Norland Products | 6801 | #68 and #63 both work well |
Coverslips #1.5 24×24 mm | Menzel Gläser | ||
Coverslips #1 24×24 mm | Menzel Gläser | used only for PDMS microstructures | |
0.5 ml reaction tube | Eppendorf | 0030123301 | |
culture flask 2L | Corning | e.g. 734-1905 | |
His-Trap HP | GE Healthcare Life Sciences | ||
Gelfiltration column: HiLoad Superdex 75 PG or 200 PG | GE Healthcare Life Sciences | ||
Econo-Pac 10DG desalting column prepacked column | Biorad | 7322010 | |
dialysis device: Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO, 0.1 – 0.5 mL or 0.5-3 mL | Termo Fisher Scientific | 66333 or 66330 | |
razor blade | |||
Instruments | |||
ultrapure water: Milli-Q Type 1 Ultrapure Water Systems | Merck | ||
automated protein purification system: Äkta Pure | GE Healthcare Life Sciences | ||
bath sonicator | Branson | e.g. Model 1510 | |
ARE-250 mixer | Thinky Corporation | ||
Plasma cleaner Zepto | Diener electronic | use oxygen as process gas | |
positive displacement pipettes | Brand | Transferpettor models with glass tips | |
LSM780 confocal laser scanning microscope | Zeiss | Fitted with Zeiss C-Apochromat 40X/1.20 water-immersion objective | |
Plasmids | |||
pET28a-His-MinD_MinE | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinD and non-tagged MinE to improve yield | |
pET28a-His-MinE | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinE | |
pET28a-His-EGFP-MinD | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-EGFP-MinD | |
pET28a-His-mRuby3-MinD | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-mRuby3-MinD | |
pET28a-His- MinC | Department of Cellular and Molecular Biophysics, MPI of Biochemistry, Prof. Schwille | plasmid encoding His-MinC |